本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤凍融產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)耐受性樹突狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腫瘤之一,手術(shù)切除為主、術(shù)后輔以放化療是目前常用的治療手段。膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),手術(shù)創(chuàng)傷及放化療又對(duì)機(jī)體免疫力產(chǎn)生抑制和破壞,致使其復(fù)發(fā)率和死亡率仍然居高不下。氬氦冷凍技術(shù)是近年來(lái)興起的一種新的腫瘤微創(chuàng)靶向治療手段,可對(duì)多種良惡性腫瘤施行精確冷凍治療,在前列腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等治療領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用于臨床。與手術(shù)切除相比較,冷凍治療不僅可直接殺傷腫瘤細(xì)胞,更重要的是激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng),從而減少腫瘤的復(fù)發(fā),改善患者的預(yù)后。樹突狀細(xì)胞(DC)是機(jī)體功能最為強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(APC),可提呈抗原并誘導(dǎo)初始型T淋巴細(xì)胞活化,從而產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。DC依賴于其不同的表型和功能狀態(tài),可以促進(jìn)免疫性或者免疫耐受性反應(yīng)。研究表明,成熟的DC可以活化初始型T細(xì)胞,而未成熟的DC也已經(jīng)應(yīng)用于免疫無(wú)效能的誘導(dǎo)。此外,一種中等成熟程度的樹突狀細(xì)胞被定義為半成熟DC。這類細(xì)胞雖然可以表達(dá)中等水平的共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子,但它們卻呈現(xiàn)出IL-12高表達(dá)、IL-10低表達(dá)的細(xì)胞表型。半成熟DC可以通過(guò)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和或T細(xì)胞無(wú)效能來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受。樹突狀細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,但同樣有研究表明腫瘤的生長(zhǎng)與DC的分化、成熟缺陷密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞及其分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以形成腫瘤微環(huán)境,在局部的腫瘤微環(huán)境中,DC前體細(xì)胞可以分化成為耐受性的半成熟DC,進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受和利于腫瘤免疫逃逸。Den Brok MH等學(xué)者已經(jīng)報(bào)道冷凍消融腫瘤組織可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。當(dāng)DC前體細(xì)胞被腫瘤凍融產(chǎn)物致敏以后,可以分化、成熟,并誘導(dǎo)免疫反應(yīng),但是腫瘤凍融產(chǎn)物是否可以阻止DC前體細(xì)胞分化成為耐受性的半成熟DC呢?本研究選用小鼠GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞系用以模擬腫瘤微環(huán)境,首先誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞分化成為耐受性半成熟DC,并對(duì)其細(xì)胞表型、功能進(jìn)行鑒定。然后,在耐受性半成熟DC的誘導(dǎo)生成過(guò)程中,添加腫瘤凍融產(chǎn)物,并對(duì)生成的各種DC的功能加以檢測(cè),以觀察腫瘤凍融產(chǎn)物在此過(guò)程中發(fā)揮的作用。第一部分 C57BL/6小鼠骨髓源耐受性樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定目的：探討培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓源耐受性樹突狀細(xì)胞的方法,并對(duì)其細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物及免疫學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞來(lái)源。方法：獲取C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白細(xì)胞介素4(rmIL-4)細(xì)胞因子對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),分為單純DC、脂多糖LPS-DC和膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清TSN-DC三組,LPS-DC組在培養(yǎng)結(jié)束前24h加入LPS, TSN-DC組在培養(yǎng)開始即加入GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。培養(yǎng)6d后收集懸浮細(xì)胞,進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型和免疫學(xué)功能的鑒定。結(jié)果：三組細(xì)胞均懸浮生長(zhǎng),具有樹突狀形態(tài)。各組細(xì)胞CD11c的表達(dá)率均在90%以上,與單純DC組細(xì)胞相比較,LPS-DC組細(xì)胞高度表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子,極少分泌IL-10,高分泌IL-12(P0.01)；TSN-DC組細(xì)胞中度表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子,大量分泌IL-10(P0.01),低分泌IL-12(P0.05)。單純DC組和TSN-DC組細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力較弱,對(duì)GL261細(xì)胞殺傷作用也較弱,兩者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,LPS-DC組細(xì)胞能誘導(dǎo)T細(xì)胞大量增殖,并對(duì)GL261細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用(P0.01)。結(jié)論：模擬腫瘤微環(huán)境,利用rmGM-CSF和rmIL-4可以從C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)培養(yǎng)出高純度的膠質(zhì)瘤耐受性樹突狀細(xì)胞。第二部分膠質(zhì)瘤凍融產(chǎn)物對(duì)耐受性樹突狀細(xì)胞功能的影響的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討膠質(zhì)瘤凍融產(chǎn)物在耐受性樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮的作用及對(duì)其免疫學(xué)功能的影響。方法：在耐受性樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中的第一天、第三天、第五天,在培養(yǎng)體系中添加膠質(zhì)瘤凍融產(chǎn)物,標(biāo)記為L(zhǎng)-1-TDCs, L-3-TDCs, L-5-TDCs,培養(yǎng)6d后收集懸浮細(xì)胞,進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型和免疫學(xué)功能如混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。結(jié)果：相比較于L-3-TDCs, L-5-TDCs, L-1-TDCs在形態(tài)學(xué)方面更具有成熟樹突狀細(xì)胞的形態(tài),并且高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子CD86(P0.01),低分泌IL-10和高分泌IL-12(P0.01),誘導(dǎo)T細(xì)胞大量增殖(P0.01),對(duì)GL261細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用(P0.01)。結(jié)論：在耐受性樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的早期,添加膠質(zhì)瘤凍融產(chǎn)物,可以阻止骨髓細(xì)胞向耐受性樹突狀細(xì)胞的分化成熟,并表現(xiàn)出具有成熟樹突狀細(xì)胞樣的免疫學(xué)特性。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41

【共引文獻(xiàn)】

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