本文關(guān)鍵詞：蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1與PS4蛋白結(jié)構(gòu)的比較與抗癌譜篩選

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【摘要】：目的:①比較蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry51Aa1蛋白與具有毒殺癌細(xì)胞活性的Parasporin蛋白之間的進化關(guān)系及結(jié)構(gòu)異同,由結(jié)構(gòu)相似性推測目的蛋白Cry51Aa1蛋白可能具有的抗癌活性;②測試Cry51Aa1蛋白的抗癌活性及抗癌譜,篩選出1-2種敏感細(xì)胞株,并初步探討Cry51Aa1對靶癌細(xì)胞發(fā)揮毒性作用的機制,為研究Cry51Aa1的功能提供新的生物學(xué)證據(jù)。方法:①采用生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫分析Cry51Aa1的理化性質(zhì)并調(diào)取其氨基酸序列信息,同時調(diào)取已報道的6類19種抗癌Parasporin蛋白序列,應(yīng)用最大似然聚類法建立Cry51Aa1與PS家族的系統(tǒng)進化樹圖,找出可能與Cry51Aa1同源的PS蛋白;針對與Cry51Aa1序列相似度最高的PS蛋白,進一步比較兩者在一級和二級結(jié)構(gòu)中的各項參數(shù),并以SWISS-MODEL進行同源建模,比較兩者的三級空間結(jié)構(gòu),全面分析兩者結(jié)構(gòu)的異同。②純化Cry51Aa1蛋白后,以18種細(xì)胞(包括12種人類腫瘤細(xì)胞,2種人類正常細(xì)胞,1種鼠腫瘤細(xì)胞,3種鼠正常細(xì)胞)作為受試對象,利用MTT實驗初步篩選Cry51Aa1對各類細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,對敏感細(xì)胞株進一步分析時間和濃度因素對細(xì)胞生存率/抑制率的影響;③以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和免疫印跡實驗(WB)探討Cry51Aa1是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。結(jié)果:①通過氨基酸序列聚類建立的系統(tǒng)進化樹圖中,Cry51Aa1與PS4的氨基酸序列相似度最高,達到36%,自引導(dǎo)評估得boostrap值(自展值)70,認(rèn)為可信度較好。從結(jié)構(gòu)比較中進一步體現(xiàn)了兩者的結(jié)構(gòu)相似性,兩種蛋白模型在α-碳原子(Carboon alpha,CA)部分的結(jié)構(gòu)差異均方根(RMS)=0.92。②Cry51Aa1易引起敏感靶細(xì)胞發(fā)生腫脹等形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞形態(tài)改變的程度與濃度梯度呈現(xiàn)一致性變化,隨著作用時間的增加,腫脹的比例減少;③不同的細(xì)胞對Cry51Aa1的敏感性存在差異,腫瘤細(xì)胞敏感性高于正常細(xì)胞,且不同腫瘤系統(tǒng)的細(xì)胞對Cry51Aa1的敏感性存在差異,篩選到的Cry51Aa1抗癌譜包括消化系統(tǒng)的SGC-7901、GBC-SD與RBE,生殖系統(tǒng)的Hela、HEC、HBL-100、MDA-MB-231;④較高濃度的Cry51Aa1引起細(xì)胞發(fā)生凋亡,且初步認(rèn)為,Caspase家族在Cry51Aa1引起的細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮了重要作用。結(jié)論:①Cry51Aa1蛋白可能與抗癌PS蛋白同源,且與PS4在氨基酸序列上親緣關(guān)系最近,兩者的結(jié)構(gòu)相似性較高;②Cry51Aa1蛋白對多種人類腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,且敏感性存在差異。本次篩選到的抗癌譜包括消化系統(tǒng)3個細(xì)胞株和生殖系統(tǒng)4個細(xì)胞株,胃癌SGC-7901表現(xiàn)最為明顯和穩(wěn)定,但Cry51Aa1的特異性毒性還需經(jīng)更大范圍的抗癌譜驗證;③Cry51Aa1引起細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力的改變,且即細(xì)胞抑制率與蛋白濃度成存在劑量-反應(yīng)關(guān)系,正比;④Cry51Aa1發(fā)揮細(xì)胞毒性可能是Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,且對細(xì)胞的遷移能力發(fā)揮一定的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3

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