本文關(guān)鍵詞：APOBEC3基因家族的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制的初步研究

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【摘要】：腫瘤發(fā)生的過程中涉及多種基因的異常,基因組不穩(wěn)定性是造成腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵,其中占人體基因組的17%的LINE-1(L1)被認(rèn)為在此過程中起著重要的作用。L1是自主性逆轉(zhuǎn)座子,在漫長的進(jìn)化過程中被認(rèn)為是早期整合到基因組中的內(nèi)病毒。L1有兩個(gè)開放的閱讀框架(ORF),編碼蛋白包括ORF-1p和ORF-2p兩個(gè)蛋白,其中ORF-2p具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,而ORF-1p的功能仍不清楚,L1逆轉(zhuǎn)座子的激活幾乎在所有癌癥中均能檢測到,是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性的主要因素,其與癌癥發(fā)生密切相關(guān)。正因如此,細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中形成了對LINE-1嚴(yán)格的限制措施,如通過對其啟動子的超甲基化,抑制其激活,但細(xì)胞在應(yīng)激條件仍可導(dǎo)致其激活,針對這種狀況,細(xì)胞中的APOBEC3家族(A3s,包括A3B,A3C,ASF, A3G, A3H)被發(fā)現(xiàn)可通過造成DNA突變的方式,實(shí)現(xiàn)對其活性的限制。A3s家族基因是一類具有功能的應(yīng)激應(yīng)答基因,當(dāng)細(xì)胞受到病毒等應(yīng)激刺激,可促進(jìn)其基因的表達(dá),該家族基因的作用機(jī)制是造成單鏈DNA中的TCW (W代表A或者T)處的胞嘧啶脫氨,結(jié)果使胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?從而導(dǎo)致DNA序列的突變。研究發(fā)現(xiàn)A3s在限制LINE-1基因活性以及一些逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的同時(shí),也會造成細(xì)胞基因組的其它基因的突變,這樣LINE-1與A3s基因家族的之間博弈,很有可能是導(dǎo)致腫瘤基因組出現(xiàn)高頻率突變的原因,為此,我們通過體外實(shí)驗(yàn)探索A3s對細(xì)胞生物學(xué)特征的影響以及可能的作用機(jī)制。 目的：研究A3s基因家族對細(xì)胞生物學(xué)特征的影響以及在腫瘤發(fā)生過程中的作用及其作用機(jī)制。 方法：(1)從Hela細(xì)胞或A549細(xì)胞中提取RNA,通過RT-PCR方法制備A3s基因,測序證實(shí)后連接到表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上。(2)在探究A3s的生物學(xué)功能方面,將構(gòu)建的A3s基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞HEK293中,使用WesternBlot鑒定其表達(dá),分別通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測分析真對HEK293細(xì)胞遷移、增殖、細(xì)胞凋亡和周期的影響。(3)A3s在腫瘤發(fā)生過程中的作用及其作用機(jī)制的研究方面：本研究探索了A3s家族蛋白與L1ORFlp之間形成蛋白復(fù)合體的可能性,由于L1ORFlp為RNA結(jié)合蛋白,進(jìn)一步探索RNA在其中的作用。在探索其對重要癌相關(guān)基因的致突變研究中,通過共轉(zhuǎn)染A3s家族基因以及TP53基因及其啟動子區(qū)、K-RAS基因后,采用3D-PCR (Differential DNA Denaturation PCR)檢驗(yàn)突變情況。 結(jié)果：通過對A3s基因家族的實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)： A3s基因的生物學(xué)功能：(1) CCK-8結(jié)果顯示,A3B, A3C、A3F、A3G過表達(dá)能明顯促進(jìn)HEK293細(xì)胞的體外增殖能力。與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比,HEK293細(xì)胞的體外增殖能力得到極顯著提高(P0.01),增長率分別為19.5%、19.9%、18.9%、15.7%;(2)AnnexinV-FITC、PI染色和流式細(xì)胞儀分析表明,A3B、A3C、A3F、A3G過表達(dá)能夠抑制HEK293細(xì)胞的凋亡,在轉(zhuǎn)染72h后,HEK293細(xì)胞的凋亡率分別為10.53%、19.02%、12.54%、13.95%,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的凋亡率為21.31%; (4)PI染色和流式細(xì)胞儀分析表明A3B、A3C、A3、A3H過表達(dá)能使HEK293細(xì)胞G0/G1期縮短,而S期延長,促進(jìn)HEK293細(xì)胞周期,此結(jié)果與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 A3s基因介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制：(1)co-IP結(jié)果表明,A3C、A3F、A3G與L1ORF-lp存在相互作用關(guān)系,當(dāng)用RNA酶處理后,發(fā)現(xiàn)這種相互作用消失,表明A3C,A3F, A3G與L1ORF-1p的相互作用是RNA介導(dǎo)的；(2)HEK293分別共轉(zhuǎn)染A3C、A3F、A3G與TP53、TP53的啟動子區(qū)、K-RAS基因質(zhì)粒探究TP53、K-RAS基因突變的產(chǎn)生的機(jī)制,結(jié)果顯示A3s過表達(dá)可增加TP53結(jié)構(gòu)基因以及啟動子區(qū)序列產(chǎn)生突變,而對K-RAS突變無明顯影響。(3)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示：A3F-HA能下調(diào)TP-53啟動子活性,而A3G-HA上調(diào)TP-53啟動子活性。 結(jié)論：上述結(jié)果證明,人胚腎HEK293細(xì)胞中A3s基因表達(dá)水平的升高可增強(qiáng)細(xì)胞的體外增殖,抑制細(xì)胞的凋亡,并造成周期的改變；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),APOBEC3蛋白可通過RNA依賴的方式與IJNE1ORF-lp發(fā)生相互作用,這為進(jìn)一步研究LINE1逆轉(zhuǎn)座子和A3s家族在腫瘤中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)APOBEC3可能誘導(dǎo)TP53、TP53啟動子區(qū)發(fā)生基因突變,且能引起TP53啟動子活性改變,而對K-RAS基因沒有影響,這對A3s誘導(dǎo)基因突變的機(jī)制以及其在腫瘤中的作用研究有著重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1175392