本文關鍵詞：APOBEC3基因家族的生物學功能及其作用機制的初步研究

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【摘要】：腫瘤發(fā)生的過程中涉及多種基因的異常,基因組不穩(wěn)定性是造成腫瘤發(fā)生的關鍵,其中占人體基因組的17%的LINE-1(L1)被認為在此過程中起著重要的作用。L1是自主性逆轉座子,在漫長的進化過程中被認為是早期整合到基因組中的內病毒。L1有兩個開放的閱讀框架(ORF),編碼蛋白包括ORF-1p和ORF-2p兩個蛋白,其中ORF-2p具有逆轉錄酶活性,而ORF-1p的功能仍不清楚,L1逆轉座子的激活幾乎在所有癌癥中均能檢測到,是導致基因組不穩(wěn)定性的主要因素,其與癌癥發(fā)生密切相關。正因如此,細胞在長期進化過程中形成了對LINE-1嚴格的限制措施,如通過對其啟動子的超甲基化,抑制其激活,但細胞在應激條件仍可導致其激活,針對這種狀況,細胞中的APOBEC3家族(A3s,包括A3B,A3C,ASF, A3G, A3H)被發(fā)現(xiàn)可通過造成DNA突變的方式,實現(xiàn)對其活性的限制。A3s家族基因是一類具有功能的應激應答基因,當細胞受到病毒等應激刺激,可促進其基因的表達,該家族基因的作用機制是造成單鏈DNA中的TCW (W代表A或者T)處的胞嘧啶脫氨,結果使胞嘧啶轉變?yōu)樾叵汆奏?從而導致DNA序列的突變。研究發(fā)現(xiàn)A3s在限制LINE-1基因活性以及一些逆轉錄病毒活性的同時,也會造成細胞基因組的其它基因的突變,這樣LINE-1與A3s基因家族的之間博弈,很有可能是導致腫瘤基因組出現(xiàn)高頻率突變的原因,為此,我們通過體外實驗探索A3s對細胞生物學特征的影響以及可能的作用機制。 目的：研究A3s基因家族對細胞生物學特征的影響以及在腫瘤發(fā)生過程中的作用及其作用機制。 方法：(1)從Hela細胞或A549細胞中提取RNA,通過RT-PCR方法制備A3s基因,測序證實后連接到表達載體pcDNA3.1(+)上。(2)在探究A3s的生物學功能方面,將構建的A3s基因重組表達載體轉染到人胚腎細胞HEK293中,使用WesternBlot鑒定其表達,分別通過細胞劃痕實驗、CCK-8實驗、流式細胞儀檢測分析真對HEK293細胞遷移、增殖、細胞凋亡和周期的影響。(3)A3s在腫瘤發(fā)生過程中的作用及其作用機制的研究方面：本研究探索了A3s家族蛋白與L1ORFlp之間形成蛋白復合體的可能性,由于L1ORFlp為RNA結合蛋白,進一步探索RNA在其中的作用。在探索其對重要癌相關基因的致突變研究中,通過共轉染A3s家族基因以及TP53基因及其啟動子區(qū)、K-RAS基因后,采用3D-PCR (Differential DNA Denaturation PCR)檢驗突變情況。 結果：通過對A3s基因家族的實驗,我們發(fā)現(xiàn)： A3s基因的生物學功能：(1) CCK-8結果顯示,A3B, A3C、A3F、A3G過表達能明顯促進HEK293細胞的體外增殖能力。與空質粒轉染相比,HEK293細胞的體外增殖能力得到極顯著提高(P0.01),增長率分別為19.5%、19.9%、18.9%、15.7%;(2)AnnexinV-FITC、PI染色和流式細胞儀分析表明,A3B、A3C、A3F、A3G過表達能夠抑制HEK293細胞的凋亡,在轉染72h后,HEK293細胞的凋亡率分別為10.53%、19.02%、12.54%、13.95%,而轉染空質粒組的凋亡率為21.31%; (4)PI染色和流式細胞儀分析表明A3B、A3C、A3、A3H過表達能使HEK293細胞G0/G1期縮短,而S期延長,促進HEK293細胞周期,此結果與細胞增殖實驗結果一致。 A3s基因介導的調控機制：(1)co-IP結果表明,A3C、A3F、A3G與L1ORF-lp存在相互作用關系,當用RNA酶處理后,發(fā)現(xiàn)這種相互作用消失,表明A3C,A3F, A3G與L1ORF-1p的相互作用是RNA介導的；(2)HEK293分別共轉染A3C、A3F、A3G與TP53、TP53的啟動子區(qū)、K-RAS基因質粒探究TP53、K-RAS基因突變的產(chǎn)生的機制,結果顯示A3s過表達可增加TP53結構基因以及啟動子區(qū)序列產(chǎn)生突變,而對K-RAS突變無明顯影響。(3)熒光素酶報告基因實驗顯示：A3F-HA能下調TP-53啟動子活性,而A3G-HA上調TP-53啟動子活性。 結論：上述結果證明,人胚腎HEK293細胞中A3s基因表達水平的升高可增強細胞的體外增殖,抑制細胞的凋亡,并造成周期的改變；機制研究發(fā)現(xiàn),APOBEC3蛋白可通過RNA依賴的方式與IJNE1ORF-lp發(fā)生相互作用,這為進一步研究LINE1逆轉座子和A3s家族在腫瘤中的作用提供了實驗基礎。此外,實驗中發(fā)現(xiàn)APOBEC3可能誘導TP53、TP53啟動子區(qū)發(fā)生基因突變,且能引起TP53啟動子活性改變,而對K-RAS基因沒有影響,這對A3s誘導基因突變的機制以及其在腫瘤中的作用研究有著重要的意義。
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

【共引文獻】

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本文編號：1175392