本文關(guān)鍵詞：Ese-3基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15增殖的影響

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【摘要】：背景結(jié)腸癌是我國(guó)臨床常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢(shì)。由于結(jié)腸癌患者發(fā)病隱匿,確診時(shí)往往已是中晚期,在臨床實(shí)踐中很多結(jié)腸癌術(shù)后患者在接受多次放、化療后,出現(xiàn)化療耐藥,從而無(wú)法有效控制局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致最終死于本病。越來越多的臨床實(shí)踐證實(shí)分子靶向藥物在腫瘤治療中的優(yōu)勢(shì),因此,尋找新的治療靶分子、研究靶分子作用機(jī)制等已成為結(jié)腸癌等腫瘤治療取得突破的希望所在。既往研究表明,Ese-3基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),在多種惡性腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào),提示Ese-3基因很有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于Ese-3基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制研究文獻(xiàn)報(bào)道甚少。目的通過免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Ese-3基因在結(jié)腸及結(jié)腸癌中的表達(dá)差異性情況,通過慢病毒介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Ese-3基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT15-Ese3,觀察該基因?qū)?xì)胞的增殖能力、克隆形成能力以及細(xì)胞周期、凋亡等增殖相關(guān)生物學(xué)特性的影響。以此初步探索Ese-3基因在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用和作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性。方法運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法對(duì)結(jié)腸癌患者術(shù)后病理標(biāo)本進(jìn)行染色,檢測(cè)Ese-3基因在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)差異性情況;在結(jié)腸癌細(xì)胞系及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中,通過Western-Blot、realtime-q PCR方法檢測(cè)Ese-3蛋白的表達(dá)情況;采用慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)Ese-3基因的細(xì)胞及相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞,運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀等方法分別檢測(cè)過表達(dá)Ese-3的HCT15細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的增殖速度、克隆形成能力及細(xì)胞周期。結(jié)果(1)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:Ese-3蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織之間的表達(dá)具有顯著差異性(P0.05)。在正常的結(jié)腸癌旁組織中,可見Ese-3呈棕黃色或棕褐色陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性顆粒主要定位于細(xì)胞核中,而在相應(yīng)的結(jié)腸癌組織中Ese-3多呈陰性表達(dá)。(2)Western-Blot結(jié)果顯示:Ese-3蛋白在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC)內(nèi)明確表達(dá),而在結(jié)腸癌細(xì)胞中未見表達(dá)(HCT116、HCT15、SW480)或低表達(dá)(HCT8、SW620)。(3)q PCR方法檢測(cè)結(jié)腸正常上皮FHC中Ese-3擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,分析結(jié)果提示擴(kuò)增曲線為S型,呈明顯的指數(shù)擴(kuò)增期;熔解曲線分析顯示Ese-3為擴(kuò)增產(chǎn)物中唯一的擴(kuò)增子。計(jì)算基因表達(dá)量結(jié)果顯示Ese-3在結(jié)腸正常上皮FHC中的表達(dá)豐度為中度。(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞增殖曲線發(fā)現(xiàn),慢病毒載體LV-Ese-3感染的HCT15細(xì)胞與空載體對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)目顯著減少,說明上調(diào)Ese-3的表達(dá),結(jié)腸癌細(xì)胞增殖速度明顯減慢。(5)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,慢病毒載體LV-Ese-3感染HCT15細(xì)胞后,與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降。(6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明,慢病毒過表達(dá)Ese-3后,HCT15細(xì)胞G0/G1期百分率增加到62.73%,S期減少到21.72%,與相應(yīng)對(duì)照HCT15-NC細(xì)胞G0/G1期48.60%、S期32.67%相比,差異有顯著性(P0.05)。結(jié)論我們的研究結(jié)果表明,Ese-3基因在結(jié)腸及結(jié)腸癌中表達(dá)具有差異性,即Ese-3基因在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)或缺失,并通過體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了Ese-3基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15細(xì)胞增殖、降低了細(xì)胞克隆形成能力、抑制細(xì)胞進(jìn)入S期的作用,提示Ese-3作為抑癌基因其表達(dá)的下調(diào)或缺失可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān),為結(jié)腸癌的臨床分子靶向治療提供重要的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35

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本文編號(hào)：1175267