本文關(guān)鍵詞：亞硝酸鹽和銨鹽聯(lián)合暴露促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲

  更多相關(guān)文章： 亞硝酸鹽 銨鹽 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞 增殖 遷徙 侵襲

【摘要】：背景:隨著農(nóng)業(yè)化肥及工業(yè)防腐劑的廣泛應(yīng)用,自然界水體和土壤中氨氮及亞硝態(tài)氮的含量逐年增加。流行病學(xué)調(diào)查顯示,氨氮及亞硝態(tài)氮污染嚴(yán)重的地區(qū),癌的發(fā)生率和死亡率逐年增高,提示亞硝酸鹽可能有致癌作用。近年來(lái),亞硝酸鹽的致癌作用受到了質(zhì)疑,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究沒有直接的證據(jù)證明亞硝酸鹽就是致癌物質(zhì),另外卻發(fā)現(xiàn)了其一系列藥用價(jià)值,比如降低高血壓和高血脂,保護(hù)器官缺血再灌注損傷等。許多學(xué)者因此建議將亞硝酸鹽開發(fā)為臨床藥物。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題,課題組認(rèn)為還需要慎重。因?yàn)閬喯跛猁}的這些藥用價(jià)值是通過(guò)其在酸性缺氧環(huán)境中還原成一氧化氮而實(shí)現(xiàn)的。腫瘤細(xì)胞生活的微環(huán)境呈現(xiàn)缺氧酸性特征,另外腫瘤微環(huán)境是一個(gè)高氨環(huán)境,在這樣的微環(huán)境中,亞硝酸鹽也會(huì)還原成一氧化氮,對(duì)腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)作用。迄今為止,還沒有發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽在高氨環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞生物作用的文獻(xiàn)。而揭示亞硝酸鹽和銨鹽共同存在的前提下,腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力會(huì)發(fā)生什么變化,對(duì)全面了解亞硝酸鹽的生物學(xué)作用有著非常重要的意義。目的:探討亞硝酸鹽和銨鹽聯(lián)合暴露對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法:實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為空白對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組、亞硝酸鈉和氯化銨混合組。采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選出最適處理濃度及最佳處理時(shí)間;微管熒光示蹤劑觀察細(xì)胞有絲分裂相初步分析細(xì)胞增殖情況;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;線粒體示蹤劑和微絲示蹤劑熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體和微絲變化,檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力;比色法檢測(cè)細(xì)胞ATP含量;Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;ELISA試劑盒檢測(cè)鳥氨酸脫羧酶(ODC)的活性;Western Blot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)的表達(dá)。結(jié)果:1.亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖活性的最適濃度和時(shí)間確定MTT結(jié)果顯示:亞硝酸鈉、氯化銨、亞硝酸鈉和氯化銨混合物(V:V=1:1)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的促增殖活性的最佳濃度皆為150μM,各處理組促增殖活性的適宜時(shí)間為24 h,混合組與其它各組相比促增殖活性更加明顯。2.微管示蹤劑觀察細(xì)胞有絲分裂相結(jié)果顯示:亞硝酸鈉組、氯化銨組與對(duì)照組相比細(xì)胞有絲分裂相略有增加,而混合組與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比有絲分裂相明顯增多,混合物組比單獨(dú)應(yīng)用亞硝酸鈉有更強(qiáng)的促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的能力。3.亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷徙和侵襲能力劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比,混合組的相對(duì)劃痕愈合距離更大,水平運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng);熒光顯微鏡下可見混合組細(xì)胞微絲形成大量應(yīng)力纖維,有大量板狀偽足和絲狀偽足的形成,線粒體數(shù)量較其他各組增多;混合組細(xì)胞ATP含量增加明顯。Trans well細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:混合組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比明顯增多,侵襲能力增強(qiáng)。Western blotting結(jié)果顯示:與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比,混合物組MMP-2和MMP-9的表達(dá)量都明顯升高,以上各結(jié)果顯示:混合物組比單純應(yīng)用亞硝酸鈉有更強(qiáng)的增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷徙和侵襲的能力。4.亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露通過(guò)ROS/ODC途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷徙和侵襲能力熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果顯示:亞硝酸鈉組、氯化銨組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度比對(duì)照組稍強(qiáng);亞硝酸鈉和氯化銨混合物組比對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度都明顯增強(qiáng)。ELISA及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組和單純亞硝酸鹽組和氯化銨組相比,混合物組鳥氨酸脫羧酶(ODC)的表達(dá)量明顯升高。結(jié)論:1.亞硝酸鹽及銨鹽聯(lián)合暴露比單獨(dú)亞硝酸鹽暴露有更強(qiáng)的促進(jìn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及侵襲作用。2.亞硝酸鹽和銨鹽聯(lián)合暴露可能通過(guò)ROS/ODC途徑促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和侵襲。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1173200