本文關(guān)鍵詞：姜黃素通過抑制NF-κB通路逆轉(zhuǎn)吸煙誘導膀胱上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

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【摘要】：背景與研究目的膀胱癌是世界上發(fā)病率較高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其中最常見的病理類型是移行上皮細胞癌,具有復發(fā)性,浸潤性和難治愈性等特點。流行病學研究已經(jīng)證實香煙暴露是膀胱癌的重要誘發(fā)因素之一,但香煙暴露與膀腫癌進展的分子機制尚未得到充分研究。研究顯示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤細胞的進展中起到至關(guān)重要的作用。大量研究證實姜黃素對多種腫瘤細胞的生長均有抑制作用。實驗著重研究香煙暴露對膀胱移行上皮細胞EMT的影響,并探討NF-κB通路在EMT中的作用及姜黃素的干預效應。方法首先通過MTT實驗篩選出對膀胱正常上皮細胞(SV-HUC-1 cells)沒有毒性的香煙懸液(cigarette smoking extract,CSE)濃度。(1)觀察CSE處理對SV-HUC-1細胞形態(tài)的影響,使用顯微鏡進行拍照并記錄。(2)利用細胞劃痕實驗和transwell小室實驗觀察CSE處理對細胞的遷移和侵襲能力的變化,并用顯微鏡拍攝記錄。(3)CSE處理后,觀察細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物蛋白及m RNA水平的變化,采用Western Blotting和q RT-PCR及免疫熒光的方法檢測。(4)接著應用Western Blotting檢測了CSE處理后細胞內(nèi)NF-κB通路標志性蛋白的變化。(5)繼而用NF-κB通路特異性抑制劑觀察其對CSE誘導的SV-HUC-1細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的逆轉(zhuǎn)效果。(6)最后將CSE和姜黃素聯(lián)合處理細胞,觀察姜黃素對CSE引起的SV-HUC-1細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果(1)通過MTT檢測不同香煙懸液濃度下的細胞活性,我們發(fā)現(xiàn)1%時細胞活性下降至80%以下,存在統(tǒng)計學意義。最終選擇香煙懸液的濃度為選用0.1%,0.25%,0.5%做為實驗劑量。(2)將SV-HUC-1細胞暴露于選定的香煙懸液下7天后,觀察細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)正常的膀胱移行上皮細胞呈現(xiàn)飽滿的圓形,橢圓形,細胞呈凝聚狀態(tài)。處理后細胞變成長梭形,形似蝌蚪狀,細胞之間較為分散。細胞劃痕實驗及transwell小室實驗證明細胞的遷移及侵襲能力升高。(3)經(jīng)香煙懸液處理7天后,Western Blotting,q RT-PCR及免疫熒光檢測細胞的標志物。發(fā)現(xiàn)上皮標志物:E-Cadherin、ZO-1表達下降,間質(zhì)標志物:vimentin、N-cadherin表達上調(diào)。(4)NF-κB通路激活,一定香煙懸液濃度下,隨著香煙懸液濃度增加,NF-κB特異性蛋白:p65,p50的核表達水平升高,胞質(zhì)中的磷酸化IKKα/β(phosphorylated IKKα/β)升高,而通路的抑制劑IκB持續(xù)降低。通過蛋白檢測證實當NF-κB通路活性被抑制劑PDTC有效抑制時,香煙懸液誘導的SV-HUC-1細胞上皮間質(zhì)化被成功逆轉(zhuǎn)。上皮標志物:E-Cadherin、ZO-1表達上調(diào),間質(zhì)標志物:vimentin、N-cadherin的表達下調(diào)。細胞形態(tài)及細胞的遷移侵襲能力被抑制。(5)姜黃素通過抑制NF-κB通路活性,達到抑制香煙懸液誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的效果。通過蛋白及基因檢測,發(fā)現(xiàn)上皮蛋白表達水平上調(diào),間質(zhì)蛋白表達水平下降。結(jié)論1、香煙懸液誘導膀胱移行上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。2、NF-κB通路在香煙懸液引起的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到重要的作用,為流行病學調(diào)查起到相互印證的作用,同時為分子靶向治療提供科學依據(jù)。3、姜黃素對膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有一定的干預治療效果,且為膀胱癌的分子治療提供了新的方向及治療后的預防提供了新的方法。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14

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