本文關(guān)鍵詞：TIPE2通過IRF4調(diào)控胃癌細胞增殖機制的研究

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【摘要】：目的研究TLR信號通路負性調(diào)節(jié)因子TIPE2在胃炎到胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能,并研究TIPE2通過誘導(dǎo)調(diào)控IRF4抑制胃上皮細胞增殖的分子機制,從而為胃癌疾病的發(fā)生發(fā)展提供了新線索。方法1.組織水平上,以免疫組織化學方法檢查不同程度胃炎組織,胃癌組織中TIPE2蛋白表達 情況。同時提取組織的RNA,通過qRT-PC R方法檢測mRNA水平上TIPE2的表達；提取TIPE2基因敲除小鼠肝、腎、小腸、心臟、胃等器官組織的RNA,利用W estern blot方法檢測蛋白水平上IRF4表達,同時通過qRT-PCR方法檢測mRNA水平上IRF4的表達情況。2.細胞水平上,通過轉(zhuǎn)染人TIPE2高表達的質(zhì)粒pRK5-tipe2進入胃上皮細胞系,使得細胞內(nèi)過表達TIPE2,檢測TIPE2在胃癌上皮細胞增殖中的作用：(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：將人TIPE2高表達質(zhì)粒pRK5-tipe2及其對照質(zhì)粒pRK5-mock轉(zhuǎn)染胃上皮細胞系A(chǔ)GS,分別于48小時、72小時后收集細胞,提取RNA和蛋白質(zhì)。通過Western blot口qRT-PCR分別在蛋白水平和mRNA水平檢測TIPE2的表達,并評估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率。(2)細胞增殖能力檢測：以2ug、4ug、8ug的濃度梯度轉(zhuǎn)染TIPE2表達質(zhì)粒pRK5-tipe2以及對照質(zhì)粒pRK5-mock進入AGS細胞,于48小時進行細胞計數(shù),以每孔300個細胞的比例加入六孔板中,培養(yǎng)至形成肉眼可見的克隆群落,比較兩組的差異。(3)研究TIPE2對細胞周期的影響：TIPE2表達質(zhì)粒pRK5-tipe2 和 pRK5-mock對照質(zhì)粒進入AGS細胞24小時、48小時、72小時,以流式細胞術(shù)分析這些細胞所處周期的變化。(4)生物芯片分析TIPE2抑制增殖可能的分子機制：AGS細胞在轉(zhuǎn)染TIPE2高表達質(zhì)粒后,進行表達譜生物芯片分析,并以Western blot和qRT-PCR方法對顯著變化的靶基因機器通路相關(guān)分子在蛋白和mRNA水平進行驗證。(5)小干擾RNA轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染TIPE2表達質(zhì)粒pRK5-tipe2對照質(zhì)pRK5-mock粒進入AGS細胞,24小時后部分AGS細胞分別轉(zhuǎn)染小干擾小時后,IRF4 RNA,48收集蛋白及提取RNA,并以口Western blot方法檢測IRF4蛋白和qRT-PCR水平,同時也檢測TIPE2蛋白與mRNA水平驗證基因敲減效率。mRNA(6)通路抑制劑：對AGS細胞系分別加入不同信號通路特有的抑制劑,72小時后收集蛋白質(zhì)檢測蛋白水平IRF4的變化,判斷TIPE2用以調(diào)節(jié)IRF4的信號通路。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示TIPE2在胃部的正常組織高表達,但在胃部慢性炎癥組織中表達降低而且與炎癥的嚴重程度呈負相關(guān),在胃癌組織中無表達；并且qRT-PCR在mRNA水平驗證了免疫組化的結(jié)果,證明在胃部疾病發(fā)生發(fā)展時TIPE2表達發(fā)生變化并且隨疾病的進展程度呈現(xiàn)負相關(guān)。2.胃上皮細胞轉(zhuǎn)染TIPE2表達質(zhì)粒后,在蛋白質(zhì)水平上TIPE2表達量明顯升高；同時能夠檢測到細胞克隆形成能力明顯受到抑制。3.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示TIPE2過表達能夠抑制S期細胞的比例,使細胞停留在G1期,表明TIPE2通過抑制細胞進入S期而抑制上皮細胞增殖。4.生物基因芯片以及蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明,IFR4表達水平與TIPE2轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)劑量依賴性；敲除TIPE2基因的小鼠器官組織內(nèi)IRF4表達下調(diào)。5.通過轉(zhuǎn)染IRF4小干擾RNA進一步驗證TIPE2是通過調(diào)控IRF4表達來發(fā)揮抑制細胞增殖的作用6.通路抑制劑結(jié)果顯示TIPE2通過NF-KB信號通路調(diào)節(jié)IRF4表達。結(jié)論1.在胃炎和胃癌組織內(nèi)TIPE2表達下調(diào)與疾病的發(fā)展呈負相關(guān)。2.TIPE2通過降低胃上皮細胞進入S期從而達到抑制細胞增殖的作用。3.TIPE2通過NF-KB信號通路調(diào)節(jié)IRF4表達進而發(fā)揮腫瘤抑制的功能。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：1168891