本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌患者血液循環(huán)DNA含量及完整性的研究

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【摘要】：(一)免提取cfDNA含量及完整性檢測方法建立及性能評價背景非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的類型,包括腺癌,鱗癌,細(xì)支氣管肺泡癌和大細(xì)胞癌。大約70%的患者在確診時,已是晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,不能得到很好的治療,所以盡早發(fā)現(xiàn)非常重要。腫瘤患者血液中的游離DNA(cell free DNA,cfDNA)包括循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),主要來源于細(xì)胞的凋亡和壞死。血液循環(huán)中的癌細(xì)胞和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞同樣釋放cfDNA,可以通過檢測cfDNA含量來估算腫瘤負(fù)荷、評價治療效果。DNA的完整性(Integrity)有別于非腫瘤人群是腫瘤患者cfDNA的另一個顯著特征。目前定量常用PCR方法,第一步需要提取血液循環(huán)DNA,這是一個極容易產(chǎn)生誤差的步驟。即便不考慮操作者的因素,提取方法和試劑的不同就會造成巨大誤差。目的研究一種方法,不經(jīng)過DNA提取步驟,直接對血液中的循環(huán)DNA進(jìn)行定量,可以去除DNA提取試劑盒和操作人員差異造成的DNA提取誤差。方法通過提取和免提取cfDNA直接定量的兩種方法來對比檢測cfDNA,比較兩者的擴(kuò)增效率,精密度及準(zhǔn)確度。結(jié)果我們通過特殊的技術(shù)工藝處理,可以直接用血清進(jìn)行定量PCR,不影響PCR反應(yīng),擴(kuò)增效率與提純DNA一致,可精確檢測出低至ng水平的血清游離DNA,檢測范圍1-10000ng/ml,本方法具有較高的準(zhǔn)確度及精密度。相比先用試劑盒提取cfDNA,在定量結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面都有顯著改善。(二)非小細(xì)胞肺癌患者cfdna含量及完整性的研究背景近年來,血液循環(huán)dna(cfdna)作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)受到越來越多人的關(guān)注,因為它的檢測創(chuàng)傷很小而且方便,所以比較容易被人們接受。cfdna的水平在健康人和良性疾病病人中較低,但是在非小細(xì)胞肺癌患者的血液中有非常明顯的增加。癌癥病人的循環(huán)腫瘤dna的完整性也是其重要特征之一。因此聯(lián)合cfdna的含量和完整性可能是診斷癌癥的一個很好的指標(biāo)。目的通過比較非小細(xì)胞肺癌患者和健康人的循環(huán)dna的含量及完整性,來評價循環(huán)dna含量及完整性用于診斷nsclc的臨床價值。方法采用本實驗室創(chuàng)立的免提取血液循環(huán)dna含量及完整性檢測的pcr技術(shù),對非小細(xì)胞肺癌患者及健康人的循環(huán)dna進(jìn)行定量,分析比較兩組的區(qū)別。結(jié)果1.nsclc病人組及健康對照組的cfdna含量中位數(shù)(四分位距)分別為212(622.25)ng/ml和65.4(290.65)ng/ml,二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05;而完整性指數(shù)(dii)的中位數(shù)(四分位距)分別是0.0764(0.276)和0.066(0.186),兩組之間的差異無顯著性,p0.05。2.cfdna含量和完整性指數(shù)(dii)在不同性別、年齡及腫瘤病理類型間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,p值均大于0.05;而在不同病理分期的組間差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05。3.循環(huán)dna含量用來區(qū)分nsclc患者和健康人群的auc是0.659,此時的敏感性為72.3%,特異性為59.5%,cut-off值為87.5ng/ml。(三)非小細(xì)胞肺癌組織egfr信號途徑相關(guān)基因突變的檢測背景目前,與nsclc靶向治療相關(guān)幾個信號途徑已經(jīng)被研究多年,其中最主要的是表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)信號途徑,針對該途徑研制開發(fā)的酪氨酸酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitor,tki),常用的藥物有厄洛替尼,吉非替尼,西妥昔單抗等,都在臨床上取得了不錯的療效。egfr信號通路中,egfr、kras、pik3等基因是否存在缺失、重排或點突變,都可以顯著影響上述靶向藥物療效。所以,臨床上在應(yīng)用靶向藥物之前,常規(guī)都會進(jìn)行相關(guān)靶點基因的檢測。目的對臨床上非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)常發(fā)生的egfr信號途徑相關(guān)基因突變進(jìn)行檢測,分析患者的突變情況與臨床因素之間的聯(lián)系。方法采集手術(shù)時nsclc患者新鮮腫瘤組織,提取基因組dna,經(jīng)過特異性引物擴(kuò)增后,用焦磷酸測序檢測待測突變。結(jié)果1.56名患者腫瘤組織中,共有9名檢出egfr19外顯子缺失突變,8名檢出21外顯子l858r堿基替換,1名檢出18外顯子g719s/c突變;還有2名檢出kras第12密碼子突變,1名檢出pik3ca的e545k點突變。綜合看來,egfr的突變率為32.14%,kras的突變率為3.57%,pik3ca突變率為1.79%。2.nsclc患者腫瘤組織的egfr的突變率在不同病理分期、病理類型之間有顯著性差異,p0.05。結(jié)論1.免提取cfdna定量pcr方法,具有較高的準(zhǔn)確度及精密度,線性范圍能夠達(dá)到1-10000ng/ml,與試劑盒提取法相比,在定量結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面都有顯著改善。2.基于LINE1基因的免提取定量PCR方法,能夠很好地對NSCLC病人的血液循環(huán)DNA含量及完整性進(jìn)行測定。3.非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)DNA含量顯著高于健康人;NSCLC病人cfDNA含量、完整性指數(shù)(DII)與患者的病理分期相關(guān),分期越早,含量及完整性越低,提示檢測此標(biāo)志物水平有助于評估疾病的嚴(yán)重程度;cfDNA含量用于診斷NSCLC的靈敏度是72.3%,特異度是59.5%,cut-off值為87.5 ng/ml,此時ROC曲線下面積是0.659。4.非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中主要檢出的突變是EGFR突變,KRAS和PIK3CA基因突變檢出率較低。EGFR突變檢出率與病理分期、病理類型都相關(guān)。分期越晚,檢出率越高;腺癌的檢出率最高。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1166938