發(fā)布時(shí)間：2017-11-08 23:07

  本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊對(duì)膀胱腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力調(diào)控機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 微囊 膀胱癌 侵襲 AKT/Snail通路

【摘要】：目的:通過應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊干預(yù)膀胱腫瘤細(xì)胞(T24細(xì)胞),探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用,并探討其中可能影響到的信號(hào)通路。方法:(1)征得參與者書面同意后,獲取人新鮮臍帶,無菌條件下提取剖宮產(chǎn)出生的健康足月新生兒的臍帶和胎盤,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng),應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中培養(yǎng),待細(xì)胞融合到80-90%時(shí),1:3傳代。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞的表面標(biāo)志,通過檢測(cè)抗人CD14,CD31,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,CD105等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),取第3-6代用于實(shí)驗(yàn)。(2)分離、鑒定h WJMSCs-MVs及蛋白定量分析,取第3-6代h WJMSCs,采用無血清低糖DMEM+0.25%BSA(牛血清蛋白)進(jìn)行培養(yǎng)48h后,收集上清培養(yǎng)基。2000g離心30min去除細(xì)胞碎片。100,000g超速離心1h,棄上清,M199重懸,100,000g離心1h,棄上清,M199 200μl重懸備用。采用乳膠珠吸附MVs后流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其膜表面分子(CD9,CD34,CD44,CD45,CD63,CD73)。采用Bradford法進(jìn)行h WJMSC-MVs蛋白定量。采用透射電鏡負(fù)染法鑒定h WJMSC-MVs。(3)探索h WJMSC-MVs對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控情況及信號(hào)通路分析:培養(yǎng)T24細(xì)胞12h后,分別加入100,μg/ml protein h WJMSC-MVs,繼續(xù)培養(yǎng)48h。應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。Western Blot檢測(cè)E-cadherin,N-cadherin,Snail,MMP2,MMP9,β-catenin,ZEB1,Vimentin表達(dá)水平;(4)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果(1)采用組織塊貼壁法成功從人臍帶中分離出h WJMSCs,經(jīng)過1-3次傳代后h WJMSCs呈貼壁生長(zhǎng),長(zhǎng)梭形,形態(tài)均一,增殖旺盛。流式細(xì)胞技術(shù)鑒定顯示h WJMSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105,而不表達(dá)CD14,CD31,CD34,CD45,這些特征符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)關(guān)于MSCs的定義。(2)采用高速離心的方法成功地從h WJMSCs上清液中分離出MVs,并行透射電鏡及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)。MVs表面表達(dá)CD9,CD44,CD63,CD73,而不表達(dá)血源性干細(xì)胞分子CD34,CD45。(3)微囊處理結(jié)果:h WJMSC-MVs處理膀胱腫瘤T24細(xì)胞后,劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組膀胱腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯降低,蛋白定量檢測(cè)結(jié)果表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)升高,N-cadherin、Vimitin、Snail表達(dá)明顯降低(P0.05)。結(jié)論(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊能夠抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力;(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊能夠抑制膀胱腫瘤細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)化作用,從而影響T24細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微囊能夠抑制AKT/Snail通路,進(jìn)而抑制侵襲及轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：1159220