發(fā)布時(shí)間：2017-11-08 22:04

  本文關(guān)鍵詞：miR-365過表達(dá)通過靶向ADAMTS-1刺激乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲

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【摘要】：背景與目的乳腺癌(Breast cancer)是全世界女性癌癥相關(guān)死亡的一個主要原因。隨著醫(yī)學(xué)的深入研究,人們逐漸認(rèn)識到可以通過改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的生物學(xué)特性而達(dá)到治療腫瘤的目的,分子靶向治療由此誕生。目前的研究表明,乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及一系列基因水平上的改變。Micro RNAs(mi RNAs)是一類保守的小分子內(nèi)源性非編碼RNAs,在多種生理病理學(xué)過程中起重要作用,包括細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡以及表觀遺傳學(xué)改變等等。mi RNAs能靶向靶基因的3′-UTR區(qū),通過抑制基因翻譯或者引起靶基因降解來調(diào)控基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)mi RNAs在乳腺癌的起始和發(fā)展中起重要作用。自從2005年首次報(bào)道了mi RNAs在乳腺癌中的差異表達(dá),隨后的一系列研究表明mi RNAs的異常表達(dá)與乳腺癌密切相關(guān)。因此基于mi RNAs的調(diào)控,進(jìn)一步研究新的腫瘤治療方法尤為重要。本研究旨在分析mi R-365及ADAMTS-1 m RNA在乳腺癌組織及癌旁組織中的差異表達(dá)及其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系,在體外實(shí)驗(yàn)中研究mi R-365對MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲能力的影響,并初步探索mi R-365與ADAMTS-1之間的靶向關(guān)系。方法1、收集64例乳腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本,采用q RT-PCR方法檢測mi R-365及ADAMTS-1 m RNA在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為mi R-365mimics轉(zhuǎn)染組(mi R-365 mimics組)、mi R-365 inhibitor轉(zhuǎn)染組(mi R-365 inhibitor組)、mi R-365 negative control轉(zhuǎn)染組(NC組)和空白對照組(Blank組),轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。3、利用CCK-8細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn),觀察mi R-365對MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。4、利用細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)觀察mi R-365對MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞周期的影響。5、利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察mi R-365對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。6、Target Scan、Pic Tar和mi Randa軟件預(yù)測mi R-365的靶基因,構(gòu)建pmir GLO與野生型和突變型ADAMTS-1 3′-UTR區(qū)的重組載體,通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ADAMTS-1是否是mi R-365的直接靶點(diǎn)。7、構(gòu)建無3′-UTR區(qū)ADAMTS-1表達(dá)載體pc DNA3.1-ADAMTS-1,通過restore實(shí)驗(yàn)分析mi R-365調(diào)控ADAMTS-1表達(dá)的作用機(jī)制。結(jié)果1.采用q RT-PCR方法檢測mi R-365及ADAMTS-1 m RNA在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示相比于癌旁組織(癌旁組織的相對表達(dá)水平為1),乳腺癌組織中mi R-365的相對表達(dá)水平(2.711±0.893)顯著升高(P0.05),而ADAMTS-1 m RNA的表達(dá)均值(0.528±0.371)明顯降低(P0.05),并且mi R-365和ADAMTS-1 m RNA的表達(dá)水平與乳腺癌患者的TNM分期有關(guān)(P0.05),而與患者的年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及雌激素和孕激素受體情況無關(guān)(P0.05)。2.MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-365 mimics后其mi R-365表達(dá)水平(MCF-7:6.274±0.591;MDA-MB-231:7.841±0.643)顯著升高,而轉(zhuǎn)染mi R-365 inhibitor后其mi R-365表達(dá)水平(MCF-7:0.216±0.148;MDA-MB-231:0.126±0.104)顯著降低,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.CCK-8細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中,相比于NC組和Blank組,mi R-365 mimics組細(xì)胞的OD450值在2day、3day、4day這三個時(shí)間點(diǎn)均有所升高,而mi R-365 inhibitor組細(xì)胞的OD450值在2day、3day、4day這三個時(shí)間點(diǎn)均有所降低,尤其是在4day時(shí)具有顯著差異(P0.05)。4.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在mi R-365 inhibitor轉(zhuǎn)染組中處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)顯著高于NC組和Blank組,同時(shí)處于S期的細(xì)胞數(shù)顯著低于NC組和Blank組(P0.05)。5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mi R-365inhibitor后穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在MDA-MB-231細(xì)胞中,mi R-365 mimics與野生型ADAMTS-1重組載體共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低(P0.05),而mi R-365 inhibitor與野生型ADAMTS-1重組載體共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性明顯升高(P0.05),而其他各組共轉(zhuǎn)染之后對熒光素酶活性沒有明顯影響。7.Restore實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞中,與僅轉(zhuǎn)染NC的細(xì)胞相比,mi R-365 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的ADAMTS-1蛋白的表達(dá)量明顯降低,處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯減少,侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.05);而共轉(zhuǎn)染mi R-365 mimics和表達(dá)載體pc DNA3.1-ADAMTS-1組和轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pc DNA3.1-ADAMTS-1組的細(xì)胞中ADAMTS-1蛋白表達(dá)量均明顯升高,處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增加,并且侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.05)。結(jié)論1.乳腺癌組織中的mi R-365異常高表達(dá),ADAMTS-1 m RNA相對明顯低表達(dá),并與乳腺癌患者的TNM分期有關(guān)。2.下調(diào)mi R-365的表達(dá)水平能抑制MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖能力,并能抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。3.mi R-365可能作為癌基因通過靶向ADAMTS-1的3′-UTR區(qū)來發(fā)揮生物學(xué)功能。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬濤;張君瑩;吳建中;唐金海;;miR-342-3p對三陰性乳腺癌化療敏感性的影響[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年05期

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本文編號：1159012