本文關(guān)鍵詞：Keap1在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其作用的研究

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【摘要】：腎細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱腎癌,Renal Cell Carcinoma)是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,在所有泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中,其發(fā)病率僅次于膀胱癌,患病率約占成人惡性腫瘤的2～3%。根據(jù)全國(guó)腫瘤登記年報(bào)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,腎癌的發(fā)病率和死亡率分別為4.5/10萬(wàn)和1.46/10萬(wàn),男性患者的發(fā)病率約是女性患者的2倍,城市人口的發(fā)病率是農(nóng)村人口的4倍。近半數(shù)腎癌患者在來(lái)院就診前已出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,局限性腎癌患者進(jìn)行手術(shù)治療后,約30%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)。近年來(lái),隨著其發(fā)病率的逐年升高,腎癌對(duì)人群的危害日益嚴(yán)重。胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(The Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)是近期發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子量為69kDa的腫瘤抑制蛋白。研究表明,在不同組織類型的腫瘤中,Keap1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯異于癌旁正常組織。在肺癌、卵巢癌、肝癌等癌癥患者腫瘤組織中,Keap1基因出現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的失活或突變；臨床分析中發(fā)現(xiàn),在卵巢癌患者腫瘤組織中,Keap1的低表達(dá)與高死亡率有關(guān)；肺癌組織免疫組化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),Keap1的表達(dá)量在正常組織和腫瘤組織之間存在顯著性差異,提示Keap1能夠作為某些腫瘤臨床診斷的潛在指標(biāo),應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)研究。Keap1調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制尚不明確,據(jù)目前的研究分析,Keap1主要通過(guò)三種不同的方式影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。1.正常條件下,Keap1與泛素連接酶E3(Cul-3)形成復(fù)合體,結(jié)合細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2),泛素化降解Nrf2,調(diào)控Nrf2-ARE信號(hào)通路,影響抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡能力以及對(duì)化療藥物和放射治療的敏感性；2.Keap1能夠抑制IKB激酶p(IKKβ)的表達(dá),IKKβ是一種重要的致癌因子,它能夠抑制多種抑癌因子的表達(dá),并且能夠激活NF-κB信號(hào)通路,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、免疫應(yīng)答、腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)等相關(guān)基因的表達(dá)；3.Keap1能夠與B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白結(jié)合,抑制Bcl-2的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前,國(guó)內(nèi)尚缺乏有關(guān)Keap1與腎癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究報(bào)道。本研究通過(guò)比較Keap1在腎癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況,結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Keap1對(duì)腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖的影響,探討Keap1在腎癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及機(jī)制。目的檢測(cè)胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)及轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)在腎癌患者臨床標(biāo)本及腎癌細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)情況,分析其表達(dá)量與臨床病理特征之間的聯(lián)系。運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Keap1對(duì)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN增殖活性和克隆形成能力的影響,探討Keap1在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用及機(jī)制。方法1.收集2014年5月至2015年4月山東大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科收治的32例腎癌患者的組織標(biāo)本,通過(guò)Q-PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平上檢測(cè)Keap1和Nrf2在腎癌腫瘤組織及癌旁正常組織內(nèi)的表達(dá)情況,并分析兩者在不同組織內(nèi)的表達(dá)差異及兩者之間的相關(guān)性。2.運(yùn)用Q-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)Keap1和Nrf2在人腎永生化皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2和人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN中的表達(dá)差異。3.構(gòu)建過(guò)表達(dá)Keap1的瞬轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN,檢測(cè)過(guò)表達(dá)Keap1后對(duì)Nrf2、Bcl-2的表達(dá)的影響。4.運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)和克隆形成法檢測(cè)過(guò)表達(dá)Keap1后對(duì)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN增殖活性及克隆形成能力的影響。結(jié)果1.臨床標(biāo)本nRNA水平和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明,Keap1在腎癌組織內(nèi)的表達(dá)低于癌旁正常組織,Nrf2在腎癌組織內(nèi)的表達(dá)高于癌旁正常組織。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,兩者在不同組織內(nèi)的表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)臨床病理資料分析得,兩者的表達(dá)強(qiáng)弱與患者病理分型存在相關(guān)性,與患者的年齡和性別沒(méi)有明顯的差異(P0.05)。2.細(xì)胞水平Q-PCR與Western Blot結(jié)果顯示,Keap1與Nrf2在兩種細(xì)胞系內(nèi)均有表達(dá),Keap1在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN中的表達(dá)低于人腎永生化皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2；Nrf2在ACHN中的表達(dá)要高于HK-2。3.在ACHN細(xì)胞系內(nèi)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Keap1質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn),Keap1的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)Nrf2的泛素化降解水平,同時(shí)也能夠抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax的表達(dá)水平。4.在過(guò)表達(dá)Keapl后,腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN的增殖活性和克隆形成能力均明顯減弱(P0.05)。結(jié)論Keap1和Nrf2在腎臟腫瘤和相應(yīng)癌旁正常組織內(nèi)均有表達(dá), Keap1在癌旁正常組織內(nèi)的表達(dá)更高,而Nrf2在腎腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)更加明顯,這兩者在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本次研究采用了配對(duì)的臨床樣本資料,增強(qiáng)了組間的均衡性,證實(shí)了Keap1在腎癌患者的不同組織間的差異性。首次證明了在。腎癌細(xì)胞系中,Keap1能夠抑制Nrf2和Bcl-2的表達(dá),并能抑制細(xì)胞增殖活性和克隆形成能力,為腎臟腫瘤的基因治療提供一個(gè)新的思路,并為臨床患者的診斷、治療以及預(yù)后效果的評(píng)估提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：1150162