本文關(guān)鍵詞：腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌趨化因子促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移

  更多相關(guān)文章： 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)移與侵襲 趨化因子 Hedgehog通路 TGF-β通路

【摘要】：【研究背景及目的】在我國,肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)通常發(fā)生在肝硬化病人的晚期[1]。HCC由于其復(fù)雜多步驟的形成過程且常常伴有肝硬化,因此是一種高度異質(zhì)性的腫瘤。所以,確定一個(gè)合適的生物靶點(diǎn)對于設(shè)計(jì)分子導(dǎo)向的肝癌治療是至關(guān)重要的�？茖W(xué)家認(rèn)為肝細(xì)胞肝癌通常起源于肝細(xì)胞并在富含各種間質(zhì)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞以及其他細(xì)胞組成的微環(huán)境中逐漸生長并進(jìn)展成肝癌。在這些豐富的間質(zhì)細(xì)胞中,腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer Associated Fibroblasts,CAFs)可以為腫瘤營造特殊的微環(huán)境促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。來自臨床和流行病學(xué)的證據(jù)都顯示了CAF與許多癌癥的預(yù)后有密切的關(guān)系,其中就包括了肝癌。盡管來源不同的CAFs顯示出異質(zhì)性,但其免疫學(xué)特征上都表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的特征而不表達(dá)上皮的指標(biāo)。在影響周圍上皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)上,CAFs與癌旁成纖維細(xì)胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs)有很大區(qū)別。在食管胃交界處腺癌和肝癌中,CAFs的α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常的成纖維細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在肝癌標(biāo)本中,癌灶中α-SMA陽性的細(xì)胞數(shù)多余癌旁中α-SMA陽性的細(xì)胞且CAFs的增殖能力強(qiáng)于PTFs。但是,肝癌細(xì)胞和CAFs/PTFs的旁分泌crosstalk機(jī)制仍然不太清楚。進(jìn)一步的研究表明CAFs可以通過分泌許多種類的炎癥因子,生長因子和趨化因子來促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。例如,CAFs可以分泌如轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor,TGF-β)和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)等可溶性細(xì)胞因子促進(jìn)正常上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。CAFs分泌的HGF能過激活乳腺癌細(xì)胞c-MET通路而增加其侵襲能力。在這些CAFs所分泌的因子中,趨化因子作為炎癥細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子,能調(diào)控炎癥細(xì)胞的生物學(xué)作用而最終影響腫瘤的微環(huán)境。在乳腺癌中,CAFs分泌的CXCL12可以招募循環(huán)系統(tǒng)中未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)腫瘤血管的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移。CAFs還可以分泌CCL5激活HCC的PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路促進(jìn)其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。這些結(jié)果均表明趨化因子可以通過改變腫瘤微環(huán)境而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展�；谝陨系难芯勘尘�,本研究主要探尋CAFs促HCC轉(zhuǎn)移和侵襲的機(jī)制。我們主要從三方面進(jìn)行研究。首先,由于HCC的轉(zhuǎn)移侵襲能力的升高常常伴隨EMT過程,所以我們試圖通過Real-Time PCR、Westerning blotting和細(xì)胞免疫熒光等技術(shù)來證明HCC與CAFs共培養(yǎng)后可以發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。第二部分,我們將CAFs與帶有熒光素酶的HCC混合后對小鼠進(jìn)行皮下成瘤,利用小動(dòng)物熒光成像技術(shù)觀察HCC在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況來確定CAFs在動(dòng)物體內(nèi)是否能提高HCC的轉(zhuǎn)移能力。第三部分研究CAFs促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移侵襲的機(jī)制,通過趨化因子蛋白芯片和ELISA篩選出CAFs和PTFs分泌差異較大的趨化因子后,研究這些趨化因子與腫瘤細(xì)胞通路的關(guān)系及CAFs與HCC的crosstalk中趨化因子作用和地位。為治療分子靶向治療肝癌提供新的策略�！狙芯糠椒ā恳弧AFs促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(一)收集CAFs和PTFs的條件培養(yǎng)基(Conditional Medium,CM)在35mm培養(yǎng)盤中培養(yǎng)CAFs和PTFs數(shù)量達(dá)到1×10~5后,換成含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24小時(shí)后收集培液,用孔徑為0.2μm的濾膜濾過后直接培養(yǎng)肝癌細(xì)胞,達(dá)到共培養(yǎng)的目的。(二)檢測CAF對肝癌細(xì)胞EMT作用將HCC細(xì)胞株Huh7接種于細(xì)胞盤貼壁后,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)后換成CAFs/PTFs的CM后進(jìn)行培養(yǎng)48小時(shí)。利用相差顯微鏡下直接觀察,Real-Time PCR,Westerning blotting,細(xì)胞免疫熒光等技術(shù)觀察和檢測HCC的大體形態(tài)變化和EMT相關(guān)指標(biāo)的變化。二、CAFs促進(jìn)HCC在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移(一)慢病毒感染肝癌細(xì)胞株P(guān)LC建立能夠表達(dá)熒光素酶的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株將帶有熒光素酶基因且具有抗嘌呤霉素特性的表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后收獲病毒原液,直接將病毒原液感染PLC細(xì)胞24小時(shí)后,加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選3天后即可得到能夠表達(dá)熒光素酶的PLC細(xì)胞。(二)皮下成瘤將PLC與CAFs或PTFs按5:1的數(shù)量(PLC細(xì)胞數(shù)量為2×10~6,成纖維細(xì)胞數(shù)量為4×10~5)比例混合后接種于NOD-SCID小鼠左前腋下,建立小鼠皮下種植瘤模型。種植八周后,當(dāng)瘤體明顯可見時(shí),腹腔注射熒光素鉀后處死小鼠。(三)動(dòng)物成像將小鼠的心、肝、腦、肺、腎、脾和左前肢脛骨剝離后放入有溶解有熒光素鉀的DMEM中在小動(dòng)物成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。統(tǒng)計(jì)每組小鼠的轉(zhuǎn)移只數(shù)和轉(zhuǎn)移器官數(shù)。(四)HE染色驗(yàn)證肝癌轉(zhuǎn)移灶將小鼠的肺甲醛固定和脛骨脫鈣處理后,石蠟包埋切片,進(jìn)行HE染色,觀察肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的癌結(jié)節(jié)和骨質(zhì)破壞情況。三、CAFs分泌趨化因子促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移的機(jī)制(一)利用趨化因子蛋白芯片和ELISA篩選出CAFs與PTFs趨化因子表達(dá)譜中差異較大的趨化因子收集三株CAFs和PTFs無血清培養(yǎng)了24小時(shí)的CM,利用Raybiotech趨化因子芯片進(jìn)行篩選。篩選出CAFs和PTFs分泌量差異較大的四種趨化因子CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16。收集13對CAFs/PTFs的CM和五株常見肝癌細(xì)胞的CM,利用CXCL16的ELISA試劑盒檢測條件培養(yǎng)基中的CXCL16的絕對含量。(二)四種趨化因子對HCC的遷移和侵襲的影響趨化因子對HCC促遷移和侵襲的作用:趨化因子按濃度梯度配制成的DMEM后加入Transwell模型下室,上室接入5×10~4個(gè)PLC或Huh7細(xì)胞,放入5%CO_2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行染色拍照和統(tǒng)計(jì)。趨化因子中和抗體抑制CAF促遷移或侵襲實(shí)驗(yàn):在CAFs或PTFs的培液中加入趨化因子的中和抗體(1μg/ml)后加入到Transwell模型下室,上室接入5×10~4個(gè)PLC細(xì)胞或Huh7細(xì)胞,放入孵箱培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行染色拍照和統(tǒng)計(jì)。(三)利用趨化因子拮抗劑拮抗肝癌細(xì)胞的趨化因子受體后抑制CAF對HCC促遷移和侵襲作用用CCR2受體拮抗劑(INCB3284 100 n M)、CCR5受體拮抗劑(Maraviroc 100n M)和CCR1/3受體拮抗劑(UCB35625 100 n M)分別處理肝癌細(xì)胞后接入transwell上室,下室加入500μl 10%CAF的CM后放入CO_2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),24h后染色統(tǒng)計(jì)遷移率。(四)CAFs對Hedgehog和TGF-β通路激活作用Huh7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒(Wnt、Hippo、NF-KB、Hedgehog、TGF-β)后,更換為CAFs或PTFs的CM培養(yǎng)24h后檢測熒光素酶表達(dá)情況,篩選出激活的通路。在饑餓處理的Huh7的培液中分別加入四種趨化因子刺激24小時(shí),收集RNA,利用Real-Time PCR檢測Hedgehog和TGF-β通路下游靶基因變化情況。在Transwell上室接入5×104個(gè)Huh7細(xì)胞后,分別加入Hedgehog和TGF-β通路抑制劑CYA(5u M)和SIS3(5u M)。下室加入分別加入含有四種趨化因子(20 mg/L)的DMEM,培養(yǎng)24小時(shí)后,染色拍照。(五)CXCL16,CCL7對于TGF-β通路重要蛋白的活化情況在培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞中加入分別含有濃度為100 ng/ml的CXCL16和CCL7的無血清DMEM培養(yǎng)基。收集15分鐘、30分鐘、1小時(shí)和2小時(shí)的細(xì)胞蛋白,利用Westerning Blotting技術(shù),檢測TGF-β通路重要蛋白激活情況。(六)四種趨化因子對于肝癌細(xì)胞EMT作用在CAF的CM中加入四種趨化因子中和抗體混合抗體,培養(yǎng)Huh7細(xì)胞24小時(shí)后,收集蛋白和RNA,利用Real-Time PCR和Westerning Blotting技術(shù)檢測EMT相關(guān)指標(biāo)的變化情況�！窘Y(jié)果】一、CAFs促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化用CAFs的CM培養(yǎng)Huh7細(xì)胞后,Huh7在形態(tài)上由原來的扁平狀逐漸變成梭形且偽足生成增多,說明Huh7的游動(dòng)能力增加。細(xì)胞免疫熒光顯示CAFs處理Huh7后間質(zhì)指標(biāo)Vimentin表達(dá)升高,上皮指標(biāo)ZO-1表達(dá)下降。利用Real-Time PCR檢測用CAFs的CM培養(yǎng)后的Huh7的m RNA后可發(fā)現(xiàn)間質(zhì)指標(biāo)如Vimentin、α-SMA、Twist1和N-cadherin表達(dá)上升,上皮指標(biāo)如ZO-1和E-cadherin表達(dá)下降。Western blotting結(jié)果表明用CAFs處理后的Huh7的間質(zhì)指標(biāo)Vimentin和α-SMA表達(dá)上升。這些結(jié)果均說明CAFs促進(jìn)Huh7發(fā)生EMT,惡性程度增加。二、CAFs促進(jìn)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移將能夠表達(dá)熒光素酶的肝癌細(xì)胞PLC和CAFs/PTFs混合后在NOD-SCID小鼠左側(cè)腋窩下進(jìn)行皮下成瘤。8周后腹腔注射熒光素鉀后處死小鼠,將其心,肝,脾,肺,腎,左側(cè)前肢脛骨和腦剝離后浸入含有熒光素鉀的DMEM中進(jìn)行活體成像,統(tǒng)計(jì)每組小鼠的轉(zhuǎn)移器官數(shù)。并且將轉(zhuǎn)移的器官進(jìn)行H-E染色確定轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果顯示與PTF組和單純PLC組相比,CAFs組小鼠器官轉(zhuǎn)移率最高,其中肺轉(zhuǎn)移率為3/8,骨轉(zhuǎn)移率為5/8,腦轉(zhuǎn)移率為2/8,且H-E染色證實(shí)了骨轉(zhuǎn)移灶和肺轉(zhuǎn)移灶。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說明CAFs具有提高HCC的轉(zhuǎn)移能力。三、CAFs促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制(一)CAFs和PTFs趨化因子表達(dá)不同趨化因子蛋白芯片顯示趨化因子CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16在CAFs中分泌量明顯高于PTFs。并且我們收集了十三對CAFs/PTFs的上清和5株HCC的培養(yǎng)上清,利用CXCL16的ELISA試劑盒檢測了CXCL16的分泌量,結(jié)果顯示十三對中7株CAFs的CXCL16分泌量高于其對應(yīng)的PTFs。(二)檢測CCL2,CCL5,CCL7和CXCL16對HCC遷移和侵襲的影響Transwell遷移/侵襲試驗(yàn)表明CCL2,CCL5,CCL7和CXCL16均可以促進(jìn)HCC的遷移。但CCL7和CXCL16即可促進(jìn)HCC遷移,也可促進(jìn)其侵襲。(三)CAFs分泌的CCL2和CCL5可以激活肝癌細(xì)胞Hedgehog通路用CAFs/PTFs的CM培養(yǎng)HCC后,利用熒光色酶報(bào)告基因檢測五條(Hedgehog,TGF-β、NF-KB、Wnt、Hippo通路)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活情況,其中只有Hedgehog和TGF-β通路被顯著激活。在Huh7中轉(zhuǎn)染了Hedgehog的報(bào)告基因質(zhì)粒后,單獨(dú)加入CCL2和CCL5均可以激活報(bào)告基因的熒光素酶活性,在CAF的CM中分別加入CCL2和CCL5的中和抗體后,可以抑制CAF對Hedgehog通路的激活作用。利用Real-Time PCR結(jié)果顯示,CCL2和CCL5均可以激活HCC中Hedgehog的下游靶基因。Hedgehog通路的抑制劑CYA可以抑制CCL2和CCL5對HCC促遷移作用。(四)CAF分泌的CCL7,CXCL16激活HCC的TGF-β通路在Huh7中轉(zhuǎn)染了TGF-β的報(bào)告基因質(zhì)粒后,加入CCL7和CXCL16均可以上調(diào)報(bào)告基因的熒光素酶活性,在CAF的CM中分別加入CCL7和CXCL16中和抗體后可以抑制CAF對TGF-β通路的激活作用。CCL7和CXCL16均可以激活HCC中TGF-β通路下游靶基因。TGF-β通路的抑制劑SIS3可以抑制CCL7和CXCL16對HCC促遷移和侵襲作用。利用Western Blotting發(fā)現(xiàn)CCL7,CXCL16可以增加HCC的smad2/3的磷酸化,說明CXCL16,CCL7可以激活TGF-β通路。(五)四種趨化因子的中和抗體可以阻斷CAF促EMT過程在CAF的CM中加入四種趨化因子中和抗體后培養(yǎng)HCC,相比單純用CAF的CM培養(yǎng)HCC,間質(zhì)指標(biāo)的升高有所下降,上皮指標(biāo)的下降有所上升。說明這四種趨化因子中和抗體可以抑制CAF對HCC促EMT作用,從反面也說明這由CAF分泌的這四種趨化因子可以促進(jìn)HCC的EMT�！窘Y(jié)論】一、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可以通過分泌趨化因子促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。二、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可以促進(jìn)HCC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。三、CAFs通腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞過分泌CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16,分別激活肝癌細(xì)胞的Hedgehog和TGF-β通路而促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Md Shaifur Rahman;Naznin Akhtar;Hossen Mohammad Jamil;Rajat Suvra Banik;Sikder M Asaduzzaman;;TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J];Bone Research;2015年01期

2 ;Roles of Chemokine Receptor 4 (CXCR4) and Chemokine Ligand 12 (CXCL12) in Metastasis of Hepatocellular Carcinoma Cells[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年05期

，

本文編號：1150137