本文關(guān)鍵詞：CTGF對(duì)體外模擬微環(huán)境中人骨肉瘤143B細(xì)胞的影響及其機(jī)制探討

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【摘要】：目的采用骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5與人骨肉瘤143B細(xì)胞共培養(yǎng)模擬微環(huán)境,研究結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)對(duì)微環(huán)境中骨肉瘤143B細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及相關(guān)分子機(jī)制。方法以人骨肉瘤143B細(xì)胞株為研究對(duì)象,將其與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5共培養(yǎng)構(gòu)建骨肉瘤微環(huán)境。采用過表達(dá)重組腺病毒方法研究CTGF對(duì)微環(huán)境中143B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等腫瘤生物學(xué)行為的影響。首先,制備感染各種腺病毒的骨肉瘤細(xì)胞并建立共培養(yǎng)體系,過表達(dá)CTGF細(xì)胞143B/AdCTGF及其對(duì)照143B/AdGFP,然后采用Transwell共培養(yǎng)體系將各組143B細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5共培養(yǎng)3d。其中,以143B+HS-5、143B/AdGFP+HS-5、143B/AdCTGF+HS-5分別為空白組(Co-Blank)、GFP對(duì)照組(Co-GFP)、CTGF過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組(Co-CTGF)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)CTGF對(duì)共培養(yǎng)體系中143B細(xì)胞活力影響；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)143B細(xì)胞的周期情況；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)143B細(xì)胞遷移侵襲能力的變化；RT-PCR和Western blot檢測(cè)共培養(yǎng)的兩種細(xì)胞中趨化因子及其受體的表達(dá)情況,以及143B細(xì)胞中整合素αvβ3的表達(dá)變化。RT-PCR和Western blot檢測(cè)骨肉瘤143B細(xì)胞中PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子的活化狀態(tài)。取骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5與各組骨肉瘤143B細(xì)胞以1：1的比例混合接種于裸鼠皮下,進(jìn)行皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。觀察瘤體生長情況,定期測(cè)瘤體體積。40天后處死裸鼠,取瘤體做組織切片,HE染色觀察腫瘤分化情況。結(jié)果構(gòu)建了CTGF過表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞143B/AdCTGF并與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5共培養(yǎng),探索CTGF過表達(dá)對(duì)處于微環(huán)境中骨肉瘤細(xì)胞的作用：①M(fèi)TT結(jié)果顯示在共培養(yǎng)體系中,Co-CTGF組143B細(xì)胞增殖較Co-GFP組加快；②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微環(huán)境中143B細(xì)胞周期變化,結(jié)果顯示Co-CTGF組143B細(xì)胞S期約為42.74%,高于Co-GFP組35.96%(p0.05)。③劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微環(huán)境中143B細(xì)胞遷移能力,Co-CTGF組劃痕愈合率為100%,顯著高于Co-GFP組(84.43±3.24)%(p0.01)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微環(huán)境中143B細(xì)胞遷移能力,Co-CTGF組穿膜細(xì)胞數(shù)(68±5.1)顯著高于對(duì)照組(34±4.2)(p0.05)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,Co-CTGF組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)(46±3.6)明顯高于Co-GFP(21±4.4)(p0.05)；④體內(nèi)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Co-CTGF組皮下瘤體較Co-GFP組體積大,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,瘤體切片后HE染色顯示各組無細(xì)胞異質(zhì)性的差異；⑤ Co-CTGF組143B細(xì)胞中整合素αvβ3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)；其中Co-CTGF組143B細(xì)胞CXCR4表達(dá)在mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),HS-5細(xì)胞中配體CXCL12在mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。⑥涉及的相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子P-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高,p-AKT、p-GSK3p蛋白水平檢測(cè)磷酸化水平顯著升高。結(jié)論在體內(nèi)外模擬骨微環(huán)境中,CTGF可以調(diào)節(jié)骨肉瘤143B細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5的相互作用,促進(jìn)骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。其可能機(jī)制為：①CTGF促進(jìn)骨肉瘤143B整合素αvβ3的表達(dá)；②CTGF促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞SDF-1的分泌從而活化SDF/CXCR4-PI3K信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子以及激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1

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