本文關(guān)鍵詞：GPR137對前列腺腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：一、研究背景:前列腺癌是中老年男性群體中較為常見的泌尿系腫瘤,2014年在西方男性腫瘤新發(fā)病例數(shù)中排名第一,死亡病例數(shù)排名第二。隨著早期前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)篩查在中國的普及,前列腺癌在中國的新發(fā)病例數(shù)也呈現(xiàn)出上升趨勢。2014年中國新發(fā)前列腺癌病人高達(dá)到十萬分之60.3,病人死亡達(dá)到十萬分之26.6,位居男性泌尿系腫瘤首位。自2000至2011的十余年間,前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)出穩(wěn)步上升的趨勢,部分患者在接受根治性手術(shù)后仍出現(xiàn)生化復(fù)發(fā),且在行內(nèi)分泌去勢治療的一至兩年后進(jìn)而轉(zhuǎn)化為去勢抵抗前列腺癌,并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。關(guān)于前列腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制至今尚不清楚,探索前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制為預(yù)測前列腺癌轉(zhuǎn)移及治療的新靶點(diǎn)提供可能。G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)在細(xì)胞信號傳導(dǎo)控制中起到主要作用。越來越多文獻(xiàn)表明GPCR家族蛋白除了在信號傳導(dǎo)的作用外,在細(xì)胞的增殖、成長及再生等發(fā)揮著重要功能。G蛋白偶聯(lián)受體137(GPR137),也叫C11orf4,GPR137A或TM7SF1L1,其細(xì)胞質(zhì)中包含了4次跨膜結(jié)構(gòu),同時(shí)在N端和C端具有信號肽的結(jié)構(gòu)。該基因定位于11cen-q13.1,最早在人類海馬體結(jié)構(gòu)中被發(fā)現(xiàn),并發(fā)現(xiàn)在肺部和泌尿系統(tǒng)中高表達(dá)。已有報(bào)道顯示,在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中沉默GPR137可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本課題通過在前列腺癌患者的組織樣本中檢測GPR137的表達(dá)水平,并收集比較Oncomine數(shù)據(jù)庫前列腺癌樣本中癌與癌旁的GPR137的表達(dá)水平;進(jìn)一步在細(xì)胞水平中用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定沉默GPR137的表達(dá)的細(xì)胞株,研究其低表達(dá)后對前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、克隆增殖等腫瘤生物學(xué)變化及相關(guān)下游分子的調(diào)控研究。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯縂PR137在前列腺癌標(biāo)本樣本中的表達(dá)水平,并進(jìn)一步探索GPR137在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)變化及分子水平變化。三、實(shí)驗(yàn)方法(一)、檢測GPR137在前列腺癌標(biāo)本及前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平并在Oncomine數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證相關(guān)表達(dá)收集在2015年長征醫(yī)院泌尿外科前列腺癌病人住院行前列腺癌根治術(shù)的臨床組織樣本37例(癌21例、癌旁16例)。運(yùn)用quantitativereal-timepcr(qpcr)、免疫組化等方法檢測癌和癌旁組織標(biāo)本中g(shù)pr137的表達(dá)水平。收集oncomine數(shù)據(jù)庫中的前列腺癌樣本信息,驗(yàn)證gpr137在癌和癌旁的差異表達(dá)。運(yùn)用qpcr及westernblot檢測前列腺癌細(xì)胞株中的gpr137的表達(dá)水平。(二)、構(gòu)建能夠穩(wěn)定沉默gpr137的慢病毒質(zhì)粒及相應(yīng)的前列腺癌細(xì)胞株模型選取轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞株du145和pc-3作為研究對象細(xì)胞株模型,并將構(gòu)建完成定向沉默基因gpr137的慢病毒質(zhì)粒shrnagpr137感染上述兩株轉(zhuǎn)移模型。觀察記錄相應(yīng)質(zhì)粒上的報(bào)告基因熒光表達(dá)情況,并進(jìn)一步用westernblot和qpcr來驗(yàn)證gpr137的沉默效率,確認(rèn)低表達(dá)gpr137的細(xì)胞株模型的建立。(三)檢測在前列腺癌轉(zhuǎn)移模型pc-3和du145中低表達(dá)gpr137后,相應(yīng)細(xì)胞株增殖、克隆形成、遷移、侵襲能力的影響并檢測細(xì)胞周期的變化情況在前期成功沉默gpr137后的細(xì)胞株模型基礎(chǔ)上,通過mtt比色法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)來檢測對細(xì)胞株生物學(xué)的影響;同時(shí)通過流式細(xì)胞分析來觀察細(xì)胞株的各細(xì)胞周期的變化情況。(四)gpr137對前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的下游分子機(jī)制的初步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默gpr137后,前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力出現(xiàn)顯著的抑制,推測該基因?qū)?xì)胞的轉(zhuǎn)移具有明顯的影響。我們進(jìn)一步對相應(yīng)的轉(zhuǎn)移相關(guān)分子,用westernblot的方法進(jìn)行了初步的探索和驗(yàn)證。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、前列腺癌癌和癌旁中g(shù)pr137的表達(dá)水平存在明顯差異(p0.0001),癌中的表達(dá)明顯高于癌旁;2、成功構(gòu)建沉默gpr137的慢病毒載體后,前列腺癌細(xì)胞株du145和pc-3的增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力都受到了顯著的抑制,同時(shí)大量細(xì)胞出現(xiàn)g0/g1期阻滯的現(xiàn)象;3、在沉默gpr137的du145和pc-3細(xì)胞株中,蛋白westernblot驗(yàn)證了轉(zhuǎn)移相關(guān)下游分子snail、slug下調(diào),同時(shí)e-cadherin出現(xiàn)上調(diào)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本課題研究表明,GPR137在前列腺癌的發(fā)生及進(jìn)展中都發(fā)揮著重要作用。沉默GPR137在轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞株模型DU145和PC-3中的表達(dá),其生物學(xué)特性顯示細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移、侵襲水平都出現(xiàn)下調(diào),預(yù)示著該受體具有潛在的治療前列腺癌分分子靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1144053