本文關(guān)鍵詞：DEPDC7基因在肝癌細胞中的功能學(xué)及其啟動子的實驗研究

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【摘要】：目的功能未知基因DEPDC7是從基因芯片數(shù)據(jù)挖掘得到,DEPDC7基因在肝癌細胞內(nèi)參與的生命活動及其分子機制鮮有報道。本研究通過探討DEPDC7基因?qū)Ω伟┘毎脑鲋�、克隆形成和侵襲遷移能力的影響,并初步鑒定了DEPDC7基因的核心啟動子區(qū)域,為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制等指明方向。方法(1)提取肝癌細胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1和SMMC-7721以及正常肝細胞L-02的DEPDC7 RNA和蛋白,通過Real-Time PCR和Western blot方法檢測DEPDC7基因在m RNA和蛋白水平上的表達差異。(2)構(gòu)建過表達重組載體pLV-DEPDC7和沉默重組載體p LV-DEPDC7-sh RNA,通過慢病毒包裝并感染細胞的方法,獲得DEPDC7過表達細胞株和沉默細胞株,并通過Real-Time PCR和Western blot方法檢測DEPDC7的表達情況。(3)利用MTT法和平板克隆法檢測各實驗組細胞的增殖能力和克隆形成能力,流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化,Transwell小室檢測細胞的侵襲遷移能力。(4)利用生物信息學(xué)方法對人DEPDC7基因的啟動子區(qū)域進行分析和預(yù)測,通過PCR法擴增DEPDC7基因近端啟動子序列,構(gòu)建一系列的啟動子區(qū)域熒光素酶報告基因載體,隨后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)并檢測各缺失片段螢光素酶活性。結(jié)果(1)與正常肝細胞L-02比較,DEPDC7的m RNA和蛋白水平在四株肝癌細胞中均是低表達。(2)成功建立DEPDC7基因過表達肝癌細胞系Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7,蛋白表達顯著提高。成功建立DEPDC7基因沉默肝癌細胞系Hep G2-RNAi,m RNA和蛋白水平均顯著降低。(3)與對照組細胞相比,DEPDC7基因表達上調(diào)可以將Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7的細胞周期阻滯在G0/G1期。相應(yīng)的,細胞增殖能力、克隆形成能力和侵襲遷移能力明顯下降。(4)與對照組細胞相比,DEPDC7基因表達下調(diào)可以將Hep G2-RNAi的細胞周期促使從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。相應(yīng)的,細胞增殖能力、克隆形成能力和侵襲遷移能力明顯增加。(5)人DEPDC7基因位于11p13。成功構(gòu)建不同長度缺失片段的啟動子重組質(zhì)粒。經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,所有的重組質(zhì)粒均表現(xiàn)出熒光素酶活性,其中DEPDC7P-3活性最強。結(jié)論(1)本研究首次探討了DEPDC7基因在肝癌細胞發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。DEPDC7基因過表達可以明顯抑制肝癌細胞生長增殖,干擾DEPDC7基因則可以明顯提高肝癌細胞增殖能力。推測DEPDC7基因參與細胞周期調(diào)控,通過調(diào)節(jié)細胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變進而調(diào)節(jié)細胞增殖能力的改變。(2)DEPDC7基因過表達可以明顯抑制肝癌細胞侵襲遷移,相反干擾DEPDC7基因則可以明顯促進肝癌細胞侵襲遷移。推測DEPDC7基因影響MMPs的表達,通過破壞MMPs和TIMPs動態(tài)平衡最終調(diào)節(jié)細胞侵襲遷移能力的改變。(3)本研究首次探討了DEPDC7基因的啟動子,并得出DEPDC7基因的核心啟動子區(qū)域可能位于-879 bp~+100 bp區(qū)域。綜上所述,本研究鑒定了一個新的肝癌相關(guān)基因DEPDC7,同時我們推測該基因在肝癌治療中可以作為一個潛在的標記基因。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1143637