發(fā)布時(shí)間：2017-11-05 09:29

  本文關(guān)鍵詞：DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞中的功能學(xué)及其啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 肝癌 DEPDC7基因 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 啟動(dòng)子

【摘要】：目的功能未知基因DEPDC7是從基因芯片數(shù)據(jù)挖掘得到,DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)參與的生命活動(dòng)及其分子機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究通過探討DEPDC7基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的增殖、克隆形成和侵襲遷移能力的影響,并初步鑒定了DEPDC7基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域,為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制等指明方向。方法(1)提取肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1和SMMC-7721以及正常肝細(xì)胞L-02的DEPDC7 RNA和蛋白,通過Real-Time PCR和Western blot方法檢測DEPDC7基因在m RNA和蛋白水平上的表達(dá)差異。(2)構(gòu)建過表達(dá)重組載體pLV-DEPDC7和沉默重組載體p LV-DEPDC7-sh RNA,通過慢病毒包裝并感染細(xì)胞的方法,獲得DEPDC7過表達(dá)細(xì)胞株和沉默細(xì)胞株,并通過Real-Time PCR和Western blot方法檢測DEPDC7的表達(dá)情況。(3)利用MTT法和平板克隆法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化,Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲遷移能力。(4)利用生物信息學(xué)方法對人DEPDC7基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析和預(yù)測,通過PCR法擴(kuò)增DEPDC7基因近端啟動(dòng)子序列,構(gòu)建一系列的啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告基因載體,隨后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)并檢測各缺失片段螢光素酶活性。結(jié)果(1)與正常肝細(xì)胞L-02比較,DEPDC7的m RNA和蛋白水平在四株肝癌細(xì)胞中均是低表達(dá)。(2)成功建立DEPDC7基因過表達(dá)肝癌細(xì)胞系Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7,蛋白表達(dá)顯著提高。成功建立DEPDC7基因沉默肝癌細(xì)胞系Hep G2-RNAi,m RNA和蛋白水平均顯著降低。(3)與對照組細(xì)胞相比,DEPDC7基因表達(dá)上調(diào)可以將Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。相應(yīng)的,細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力和侵襲遷移能力明顯下降。(4)與對照組細(xì)胞相比,DEPDC7基因表達(dá)下調(diào)可以將Hep G2-RNAi的細(xì)胞周期促使從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。相應(yīng)的,細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力和侵襲遷移能力明顯增加。(5)人DEPDC7基因位于11p13。成功構(gòu)建不同長度缺失片段的啟動(dòng)子重組質(zhì)粒。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,所有的重組質(zhì)粒均表現(xiàn)出熒光素酶活性,其中DEPDC7P-3活性最強(qiáng)。結(jié)論(1)本研究首次探討了DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。DEPDC7基因過表達(dá)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞生長增殖,干擾DEPDC7基因則可以明顯提高肝癌細(xì)胞增殖能力。推測DEPDC7基因參與細(xì)胞周期調(diào)控,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力的改變。(2)DEPDC7基因過表達(dá)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移,相反干擾DEPDC7基因則可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲遷移。推測DEPDC7基因影響MMPs的表達(dá),通過破壞MMPs和TIMPs動(dòng)態(tài)平衡最終調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲遷移能力的改變。(3)本研究首次探討了DEPDC7基因的啟動(dòng)子,并得出DEPDC7基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域可能位于-879 bp~+100 bp區(qū)域。綜上所述,本研究鑒定了一個(gè)新的肝癌相關(guān)基因DEPDC7,同時(shí)我們推測該基因在肝癌治療中可以作為一個(gè)潛在的標(biāo)記基因。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1143637