本文關(guān)鍵詞：乳酸誘導肺腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究

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【摘要】：背景與目的調(diào)查研究表明肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤,目前來說相對的5年生存率僅為18%,造成肺癌患者遠期生存率較低的主要原因是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移,研究數(shù)據(jù)表明,約80-90%的肺癌患者的死亡是由腫瘤的轉(zhuǎn)移引起的,因此,探討肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制并采取相應的預防、治療措施具有重大的臨床意義和社會意義。肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)、漸進的涉及多基因并且有諸多步驟的動態(tài)過程,可能涉及到多個細胞信號通路的改變和關(guān)鍵基因結(jié)構(gòu)、功能的異常。近年研究表明在腫瘤有氧糖酵解過程中,乳酸的不斷積累與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系,而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作為腫瘤轉(zhuǎn)移的一個早期事件可能會受到乳酸積累的影響,所以本研究就乳酸對腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響進行探討,進而研究乳酸對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。有研究表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程受幾種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄因子Snail是已知可以調(diào)節(jié)上皮細胞標志蛋白的一個關(guān)鍵因子,因此本研究進一步探討了乳酸是否通過影響轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。本文旨在深入研究乳酸和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的聯(lián)系及其分子機制,有利于進一步闡明腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制,從而為腫瘤治療提供新的靶點和思路。材料與方法選取人非小細胞腺癌細胞株H1299作為研究對象。⑴采用Transwell小室實驗研究乳酸對H1299細胞株遷徙能力的影響,統(tǒng)計穿過ECM膜的細胞數(shù)目,進行統(tǒng)計分析,繪制柱狀圖。⑵用不同濃度的乳酸(5、10、15、20、30m M)刺激H1299細胞,通過Western blotting方法檢測EMT分子標志蛋白的變化,應用Image J軟件計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值,統(tǒng)計分析后繪制蛋白灰度比值的柱形圖。⑶在H1299細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染LDHA si RNA,隨后用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效率及EMT標志物的變化,計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值并繪制蛋白灰度比值的柱形圖。⑷在H1299細胞外,用不同濃度乳酸對其進行刺激,應用Western blotting方法檢測細胞內(nèi)Snail的變化⑸通過RNA干擾的方法沉默糖酵解關(guān)鍵酶LDHA,利用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染前后Snail的變化。⑹沉默轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達后,通過Western blotting檢測Snail表達沉默前后H1299細胞在乳酸作用下EMT標志物蛋白水平的變化。結(jié)果1、20m M乳酸處理組較10m M組H1299細胞穿透ECM膜的細胞數(shù)量增多,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.016)2、5,10,15,20,30mM乳酸處理H1299細胞后,細胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達下調(diào),Fibronectin表達上調(diào),且各自的蛋白灰度比值與0m M對照組相比具有統(tǒng)計學差異,且兩兩相比,差異均具有統(tǒng)計學意義。3、LDHA si RNA轉(zhuǎn)染H1299細胞后,LDHA蛋白較對照組表達水平下降,上皮標志蛋白E-cadherin的表達水平較對照組上調(diào)且兩者灰度比值差異都具有統(tǒng)計學意義(p=0.000,0.000)。4、5、10、15、20、30m M乳酸處理H1299細胞后,轉(zhuǎn)錄因子Snail表達上調(diào),且各自的蛋白灰度比值與0m M對照組相比具有統(tǒng)計學差異(p0.05),且兩兩相比差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。用LDHA si RNA轉(zhuǎn)染H1299細胞后,與對照組相比LDHA蛋白和Snail蛋白表達均下降且灰度比值差異都具有統(tǒng)計學意義(p=0.000,0.000)。5、10m M乳酸處理后,Snail si RNA組和NT si RNA組相比Snail蛋白表達下調(diào)且灰度比值具有顯著差異性(p=0.000);E-cadherin蛋白表達上調(diào)且灰度比值具有統(tǒng)計學意義(p=0.000);Fibronectin蛋白表達下降且灰度比值具有統(tǒng)計學意義(p=0.000)。結(jié)論1、乳酸可以促進H1299細胞的體外遷徙能力,隨著乳酸濃度增加細胞體外遷徙能力增加,二者呈正比關(guān)系。2、在H1299細胞內(nèi)和細胞外乳酸均可以誘導EMT上皮細胞標志物的表達下降和間質(zhì)細胞標志物的表達上調(diào),說明乳酸可以促進EMT的發(fā)生。3、乳酸可以誘導H1299細胞株轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白表達的增加,沉默Snail的表達可以抑制并部分逆轉(zhuǎn)乳酸誘導H1299細胞的EMT。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1141871