本文關鍵詞：EAAL細胞聯(lián)合全反式維甲酸對人肺腺癌細胞株A549體內外作用的研究

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【摘要】：目的:觀察體外擴增活化的自體淋巴細胞(Expanded ActivatedAutologouse Lymphocytes,EAAL)與全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)聯(lián)合應用對肺癌細胞株A549及裸鼠肺癌移植瘤的殺傷作用,探討兩者聯(lián)合應用的相關機制,為開展有效的肺癌生物治療提供實驗和理論依據。方法:1 EAAL細胞與全反式維甲酸對A549細胞體外作用研究:實驗主要分為4組,依次為Control組,EAAL組,ATRA組,EAAL+ATRA組。(1)光學顯微鏡下觀察各組A549細胞形態(tài)學的變化。(2)SRB比色法檢測各組A549細胞生長增殖變化。(3)細胞劃痕實驗檢測各組A549細胞遷移能力。(4)流式細胞術檢測各組A549細胞周期分布情況。(5)RT-PCR技術檢測A549細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax及Survivinm RNA的表達情況。(6)免疫組化技術及western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Survivin的表達情況。2 EAAL細胞與全反式維甲酸對A549細胞裸鼠皮下移植瘤體內作用研究裸鼠成瘤后隨機分為6組,依次為:空白對照組(生理鹽水組)、陽性對照組(0.5mg/kg,DDP)、ATRA組(15mg/kg)、EAAL細胞組(1×107個/次)、EAAL細胞與ATRA同時聯(lián)合應用組、EAAL細胞與ATRA序貫聯(lián)合應用組。(1)處理過程中,隔日測量裸鼠腫瘤體積,建立各組腫瘤生長曲線;處理結束后,處死全部裸鼠,完整剝除瘤體,測量腫瘤塊兒體積,計算腫瘤抑制率,比較各組對腫瘤生長的影響,HE染色觀察腫瘤細胞形態(tài)學變化。(2)免疫組化技術檢測各組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞的凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Survivin的表達情況。結果:1將EAAL細胞和/或ATRA作用于A549細胞48h后,隨著ATRA的濃度和EAAL細胞效靶比的升高,A549細胞開始出現皺縮、變圓、脫落、體積變小及數量減少等形態(tài)學方面的改變,并且可見凋亡小體。而對照組A549細胞大小均勻、生長密集。與對照組相比,EAAL細胞或ATRA單獨處理組對A549細胞的形態(tài)學方面的殺傷效果顯著,EAAL+ATRA組對A549細胞形態(tài)學殺傷作用較以上各單獨處理組均有明顯增強。2 SRB實驗結果顯示,ATRA和EAAL細胞對A549細胞增殖有顯著的抑制作用(P0.05),并且存在濃度(效靶比)和時間依賴性,ATRA的最適濃度為10-5mol/L,EAAL細胞的最適效靶比為50:1,并且EAAL聯(lián)合ATRA處理對A549細胞殺傷活性與對照組和單獨使用ATRA或EAAL細胞相比,其殺傷活性均明顯增加(P0.05)。3經ATRA(10-5mol/L)或EAAL細胞(50:1)單獨或二者聯(lián)合處理后,與對照組相比,A549細胞的遷移速度均有所減慢(P0.05),其中聯(lián)合處理組的遷移速度的減慢更為顯著,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4流式細胞術分析結果顯示,經ATRA(10-5mol/L)或EAAL細胞(50:1)單獨或二者聯(lián)合處理后,與對照組相比,A549細胞周期均有延遲,其中G1期比例明顯升高,S、G2/M期比例下降,聯(lián)合處理組相對單獨處理,A549細胞周期延遲更為顯著(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。5 RT-PCR實驗結果顯示,與對照組相比,ATRA(10-5mol/L)和EAAL細胞(50:1)單獨或二者聯(lián)合處理后,A549細胞Bcl-2和survivin的m RNA表達水平均降低(P0.05),聯(lián)合處理組相對單獨處理,表達水平降低更為顯著(P0.05);Bax m RNA表達水平均增高,聯(lián)合處理組相對單獨處理,Bax m RNA表達水平升高更為顯著(P0.05)。6免疫組化和Western blot實驗結果顯示,經ATRA(10-5mol/L)和EAAL細胞(50:1)單獨或二者聯(lián)合處理后,A549細胞Bcl-2和survivin蛋白表達水平與對照組相比均降低(P0.05),聯(lián)合處理組相對單獨處理,表達水平降低更為顯著(P0.05),Bax表達水平均增高(P0.05),聯(lián)合處理組相對單獨處理,A549細胞Bax表達水平升高更為顯著(P0.05)。7將A549細胞移植于36只裸鼠右前上肢腋下中外側皮下后均成瘤,成瘤率為100%。用藥期間各組(空白對照組、DDP組、ATRA組、EAAL細胞組、EAAL細胞與ATRA同時組、EAAL細胞與ATRA序貫組)荷瘤裸鼠飲食及精神狀態(tài)未見明顯異常;用藥前各組裸鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),處理結束后測量各組裸鼠體重,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。處理期間(空白對照組、DDP組、ATRA組、EAAL細胞組、EAAL細胞與ATRA同時組、EAAL細胞與ATRA序貫組)荷瘤裸鼠腫瘤體積仍在增大,各用藥組腫瘤抑制率分別為74.2%、30.8%、44.2%、73.2%、73.6%,除ATRA組和EAAL組(P0.05)、ATRA與EAAL細胞同時組和序貫組(P0.05)無顯著差異外,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),且兩聯(lián)合處理組的腫瘤抑制率顯著高于兩單獨處理組(P0.05)。8免疫組化分析結果:實驗各組Bcl-2的免疫反應積分顯示,與空白對照組相比,EAAL或ATRA單獨處理組荷瘤裸鼠腫瘤組織Bcl-2蛋白表達水平均明顯下降(P0.05),兩單獨處理組之間無顯著性差異(P0.05),二者聯(lián)合處理組(同時組+序貫組)與空白對照組和兩單獨處理組相比均顯著降低(P0.05),兩者同時作用組和序貫作用組之間無顯著性差異(P0.05);兩聯(lián)合處理組較兩單獨處理組荷瘤裸鼠腫瘤組織,對Bax蛋白表達增高水平更為顯著(P0.05);EAAL和ATRA單獨或聯(lián)合處理均能降低荷瘤裸鼠腫瘤組織survivin表達水平(P0.05),且兩聯(lián)合處理組較兩單獨處理組顯著下調Survivin蛋白水平的表達(P0.05)。9 ELISA結果:實驗各組裸鼠血清IL-2和IFN-γ的分泌水平檢測結果顯示,聯(lián)合處理組(同時組和序貫組)與空白對照組和兩單獨處理組相比,IL-2和IFN-γ的分泌水平均顯著升高(P0.01)。結論:1 EAAL細胞與ATRA聯(lián)合作用對肺腺癌細胞A549增殖抑制、細胞周期阻滯和促凋亡具有顯著的協(xié)同作用。2 EAAL細胞和ATRA聯(lián)合應用可下調Bcl-2和survivin并上調Bax的表達水平,提示聯(lián)合作用可能通過影響凋亡相關基因的表達而發(fā)揮作用;并增強IL-2、IFN-γ的分泌,增強對A549細胞的殺傷能力,從而抑制腫瘤細胞在體內外的生長。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：1140897