本文關(guān)鍵詞：PADI4在ATRA誘導(dǎo)HL-60細胞分化過程中的作用及其信號通路調(diào)控研究

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【摘要】：背景白血病是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病,因白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻而停滯在細胞發(fā)育的不同階段,是導(dǎo)致人類死亡的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示,白血病每年發(fā)病率約為3-4/105,約占惡性腫瘤總發(fā)病率的5%,我國每年新增白血病患者40 000多例,其中20 000多例患者是兒童。骨髓移植(Bonemarrow transplantation,BMT)是急性白血病最有效治療方法,但受費用昂貴,風險大,HLA相同的供體不足等條件限制,且移植后合并癥較多,早期死亡率高,在國內(nèi)推廣使用尚有困難。目前,白血病屬于血液系統(tǒng)的惡性克隆性疾病,大部分仍無法徹底治愈,聯(lián)合化療仍是急性白血病的主要治療手段。近年來的研究發(fā)現(xiàn),全反式維甲酸(All-Trans-Retinoic Acid,ATRA)又名維A酸,其他名如維甲酸、維A甲酸等,化學(xué)名稱為(13E)分子式為C20H2802,主要是維生素A酸的衍生物,為維生素A在體內(nèi)的中間代謝產(chǎn)物,是維持生長發(fā)育不可缺少的物質(zhì),可以誘導(dǎo)VSMC分化及抑制VSMC增殖。維甲酸受體(retinoic acid receptor,RAR)是一種重要的細胞核受體,有α、β、γ三種亞型,在VSMC中存在的RARα與ATRA結(jié)合后誘導(dǎo)VSMC分化。Krüppel樣因子4(krüppel-like factor,KLF4)是含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子,在VSMC增殖、分化、遷移及凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。因此ATRA具有很強的誘導(dǎo)細胞分化及免疫調(diào)節(jié)作用,是目前國內(nèi)治療急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocyticleukemia,APL)、骨髓異常增生等血液惡性疾病的臨床首選藥.肽�；彼崦搧啺访�--PADI4(Peptidylarginine deiminase 4),包含2238個堿基對,編碼663個氨基酸,分子量為67KDa,廣泛分布于動物組織中,其編碼的酶可以催化精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基,此過程稱為瓜氨酸化。該過程需要Ca2+的協(xié)助,轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基的蛋白構(gòu)象也發(fā)生改變,從而導(dǎo)致酶的活性變化。已有研究表明在不同的實體瘤中PADI4高表達,在HL-60等不同類型的白血病細胞株中PADI4的表達情況有所不同PADI4在造血細胞中很少表達,但是在經(jīng)ATRA誘導(dǎo)HL-60細胞向粒細胞以及巨噬細胞分化過程中可以檢測到PADI4的表達,因此考慮PADI4和白血病細胞的分化與凋亡有關(guān)。但是在生理狀態(tài)下,PADI4在白血病的分化過程中的功能及其作用的機制還不是很明確。有報道表明全反式維甲酸可以明顯的誘導(dǎo)白血病細胞HL-60向粒系分化。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)在白血病的治療過程中,MAPK,PI3K/Akt和NF-κB等信號通路參與基因表達調(diào)控、細胞增殖和凋亡的過程。其中ERK1/2是MAPK家族成員,分子量分別為44k Da和42k Da,磷酸化的P44/42有介導(dǎo)細胞因子轉(zhuǎn)錄活化的作用,并參與細胞增殖與分化。PI3K/Akt通路廣泛存在細胞中,是參與細胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通因此,本研究擬以ATRA誘導(dǎo)HL-60細胞為分化模型,初步探討PADI4在白血病細胞分化過程中的變化規(guī)律,并進一步深入探討PADI4參與ATRA誘導(dǎo)HL-60細胞分化過程中MAPK,PI3K/Akt和NF-κB等信號通路是否發(fā)揮作用,揭示PADI4影響白血病細胞分化的分子機制。這為白血病的新治療方案提供了重要的理論依據(jù),對治療白血病有著重大的意義。目的本課題在以上研究背景的基礎(chǔ)上,探討在全反式維甲酸誘導(dǎo)早幼粒白血病細胞HL-60細胞向粒系分化過程中PADI4的表達變化與功能機制。通過體外實驗探討PADI4基因與白血病細胞HL-60細胞分化是否有關(guān)為切入點,重點觀察HL60細胞經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)向粒系分化后PADI4表達變化,以及調(diào)控PADI4表達后對MAPK,PI3K/Akt和NF-κB等信號通路影響,擬驗證PADI4基因與白血病的關(guān)系,為白血病的臨床治療提供一個新的治療靶點。方法ATRA誘導(dǎo)HL-60細胞24 h、48 h、72 h、96 h后,應(yīng)用Wright-Gimesa染色觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化;運用流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b的表達變化;應(yīng)用RT-PCR分析PADI4在基因水平的表達趨勢,Western blot的方法檢測PADI4在蛋白水平的表達變化;RNAi技術(shù)干擾PADI4及PADI4抑制劑后流式細胞儀檢測CD11b變化,Western blot檢測PADI4、P42/44、P65、P105、P55等蛋白水平變化。統(tǒng)計學(xué)分析試用spss17.0軟件。結(jié)果HL-60細胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后與對照組相比,Wright-Gimesa染色顯示細胞核明顯縮小,核仁消失.胞漿變多,核漿比明顯減小,核有凹陷及分葉,桿狀核、分葉核現(xiàn)象明顯增多;細胞表面分子CD11b表達由2.1%升高到48.9%(P0.05);隨著ATRA誘導(dǎo)時間的延長PADI4在基因和蛋白水平都有增高趨勢;干擾PADI4表達后,或者使用PADI4抑制劑后再用ATRA誘導(dǎo)72h,PADI4蛋白表達量降低,HL-60細胞CD11b表達降低,磷酸化的P42/44蛋白水平降低,P65、P105、P55等蛋白水平變化均不明顯。結(jié)論ATRA誘導(dǎo)HL-60細胞定向粒系分化的過程中,PADI4促進HL-60細胞向粒系分化,而且PADI4可能是通過促進MAPK信號通路中的p42/44磷酸化而發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：濟南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

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本文編號：1139910