本文關(guān)鍵詞：人甲狀腺癌中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

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【摘要】：研究背景：惡性腫瘤是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一,關(guān)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及治療一直是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。甲狀腺癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤,約占全身惡性腫瘤的1%,根據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)告該發(fā)病率約為0.5～10/10萬,而近年來有呈上升發(fā)展的趨勢。根據(jù)甲狀腺腫瘤分化的程度,甲狀腺癌根據(jù)組織學(xué)分型可以分類為分化型甲狀腺癌及未分化型甲狀腺癌。根據(jù)組織學(xué)來源,分化型甲狀腺癌又可以分類為乳頭狀甲狀腺癌和濾泡狀甲狀腺癌,前者占全部甲狀腺癌的75%,后者占16%；另有甲狀腺髓樣癌,占5%；未分化型甲狀腺癌,占3%。不同病理類型的甲狀腺癌,其生物學(xué)特性、臨床表現(xiàn)、診斷治療及預(yù)后均有所不同。甲狀腺癌中絕大部分為高分化癌,預(yù)后較好。但亦有一些低分化或未分化甲狀腺癌,易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,患者在診斷時(shí)常已進(jìn)入臨床晚期,其對目前的臨床治療包括手術(shù)、放射碘以及終身服用左旋甲狀腺素的替代等治療手段療效不佳,預(yù)后較差。因此,研究甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制具有非常重要的臨床意義。傳統(tǒng)的理論認(rèn)為,惡性腫瘤的形成是由成熟的細(xì)胞突變而來的,它的形成是由均一的腫瘤細(xì)胞共同增殖、發(fā)展及突變而構(gòu)成的。而近年來的研究表明,腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性,也就是說并不是所有的腫瘤細(xì)胞都具有形成新腫瘤的能力。新近的研究發(fā)現(xiàn)[3],惡性腫瘤組織中存在著少量干細(xì)胞樣亞群,它具有無限增殖的潛能,其在啟動(dòng)惡性腫瘤形成和生長中起著決定性的作用,而其余的大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞,經(jīng)過短暫的分化而最終死亡。惡性腫瘤的生長是腫瘤組織中少量具有特殊表面標(biāo)志的腫瘤干細(xì)胞增殖的結(jié)果,這一理論提示著,在惡性腫瘤的治療中應(yīng)針對在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起決定性作用的腫瘤干細(xì)胞,而不是大部分無增殖、分化能力的腫瘤實(shí)體細(xì)胞。越來越多的證據(jù)表明,惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移需要這樣的細(xì)胞亞群,它們具有干細(xì)胞的特征,因而被稱為腫瘤干細(xì)胞。惡性腫瘤進(jìn)行性生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)與干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有許多相似之處,腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞的共性分別有：(1)都具有自我更新和增殖能力,但腫瘤細(xì)胞增殖不受正常機(jī)體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)控,是失去調(diào)控的；(2)都具有不同的表型和異質(zhì)性,干細(xì)胞表面特殊的表型用于調(diào)控自身增殖及周圍細(xì)胞分化的功能,腫瘤干細(xì)胞亞型不同,其生長分化能力、侵襲能力及耐藥性也不同；(3)相似的生長調(diào)節(jié)機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,都具有端粒酶活性,在正常干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),端粒酶活性和附加基因突變是正常干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的兩個(gè)必要條件；(4)都具有多分化潛能；(5)都有相似的表面標(biāo)志物,如正常造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞都表達(dá)CD34和CD90。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說從一個(gè)嶄新的角度闡述了惡性腫瘤發(fā)病的起源問題,其研究的視線開始從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)向?yàn)槟[瘤干細(xì)胞,并從這個(gè)新的角度重新理解惡性腫瘤發(fā)展的生物學(xué)行為。該學(xué)說認(rèn)為,腫瘤干細(xì)胞不僅主導(dǎo)著惡性腫瘤的發(fā)生,更與惡性腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展,包括復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,以及腫瘤對放、化療的耐受性等密切相關(guān)。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞理論提示,甲狀腺癌的發(fā)生可能也來源于甲狀腺癌干細(xì)胞,因此,從甲狀腺癌組織中分選和鑒定出甲狀腺癌干細(xì)胞對研究甲狀腺癌形成的生物學(xué)機(jī)制及臨床預(yù)防、診斷和治療十分重要。腫瘤干細(xì)胞篩選最常用的手段是利用腫瘤干細(xì)胞表面特異標(biāo)志物,可分為熒光活化細(xì)胞分選術(shù)和免疫磁珠分選術(shù)。而不依賴于細(xì)胞表面標(biāo)記的側(cè)群細(xì)胞分選法,則是利用干細(xì)胞能夠?qū)晒馊玖螲oechst33342外排的特性,對Hoechst33342拒染或淡染,通過流式細(xì)胞儀對這一部分細(xì)胞進(jìn)行分選或檢測,利用這種特性分選的這部分腫瘤細(xì)胞稱為側(cè)群細(xì)胞。側(cè)群細(xì)胞是一個(gè)特殊的細(xì)胞亞群,它的分化狀態(tài)介于胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞之間。它具有多向分化、無限增殖及自我更新潛能。目前已從多種腫瘤如膽囊癌、肺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤等中分選出了側(cè)群細(xì)胞,并同時(shí)證實(shí)了這些細(xì)胞亞群具有自我更新和多向分化的干細(xì)胞特性。與利用腫瘤干細(xì)胞表面特異標(biāo)志物篩選腫瘤干細(xì)胞的方法相比,側(cè)群細(xì)胞分選法更為經(jīng)濟(jì)方便,同時(shí)還可用以表型標(biāo)記未知的癌干細(xì)胞的分選。由于側(cè)群細(xì)胞具有成熟的分選方法,本研究擬以人甲狀腺癌組織為研究對象,采用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選出人甲狀腺癌側(cè)群細(xì)胞和非側(cè)群細(xì)胞,通過Western blot來檢測側(cè)群細(xì)胞和非側(cè)群細(xì)胞在Oct-4、ABCG2表達(dá)方面的差異,對分選出的側(cè)群細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定,探索在人甲狀腺癌中是否存在具有干細(xì)胞特性的側(cè)群細(xì)胞,為甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。研究目的：1、利用流式細(xì)胞分選技術(shù),探索在人甲狀腺癌組織中是否存在具有干細(xì)胞特性的側(cè)群細(xì)胞；2、從人甲狀腺癌組織中分離、培養(yǎng)及鑒定干細(xì)胞亞群,初步研究甲狀腺癌細(xì)胞中干細(xì)胞亞群的生物學(xué)特性。研究方法：1、人甲狀腺癌組織來源細(xì)胞的原代培養(yǎng)及細(xì)胞傳代：收集標(biāo)本,并原代培養(yǎng)甲狀腺癌細(xì)胞。本研究人甲狀腺癌組織,取材于南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院普通外科,經(jīng)手術(shù)切除的甲狀腺癌標(biāo)本,并經(jīng)病理證實(shí)為甲狀腺癌后,行分離培養(yǎng)出甲狀腺癌細(xì)胞；無菌條件下將新鮮甲狀腺癌組織洗凈剪碎,經(jīng)0.1%的胰酶和0.025%的Ⅰ型膠原酶37℃消化30 min,然后濾網(wǎng)過濾去渣,4℃下500×g離心5 min,去除上清；用5ml含有20%人血漿的DMEM-E培養(yǎng)基孵育5mmin,細(xì)胞重懸后經(jīng)20%的Percoll在4℃下1500×g離心15min,收集含細(xì)胞的沉淀,再經(jīng)DMEM-E洗滌2次,每次4℃下500×g離心5min。所獲細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中,以含有10% FBS、100 g/ml牛腦抽提物、2mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的DMEM-E培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,棄上清,洗掉非貼壁細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng),1周后挑取多個(gè)形成的集落,混均勻,移至新瓶培養(yǎng)。第8代時(shí)挑取非鋪路石樣形態(tài)的細(xì)胞集落,然后分開培養(yǎng)。2、利用流式細(xì)胞術(shù)分選側(cè)群細(xì)胞及非側(cè)群細(xì)胞：收集上述培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml,參照Kondo等的方法,將甲狀腺癌細(xì)胞群消化為單細(xì)胞懸液,加入Hoechst33342染料至終質(zhì)量濃度為5μg/ml,而對照組則加入維拉帕米至終質(zhì)量濃度50μg/ml,37℃孵育90 min,棄上清,用預(yù)冷PBS洗3次,加入碘化丙啶至終質(zhì)量濃度2μg/ml。以350nmμV激發(fā)光源、610nm雙色短通反射濾鏡、450、675nm邊緣長通濾片分別檢測散射光藍(lán)光及紅光部分,線性模式采集信號,將細(xì)胞中熒光信號分為兩個(gè)部分,以Hoechst紅點(diǎn)為x軸,Hoechst藍(lán)點(diǎn)為y軸作二維散點(diǎn)圖,將低Hoechst紅點(diǎn)及低Hoechst藍(lán)點(diǎn)且對照組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的“門”,分別分選出SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞。3、運(yùn)用Western blot法檢測ABCG2、Oct-4蛋白的表達(dá)：三去污劑法分別提取甲狀腺癌SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2h,漂洗后與一抗(1：200稀釋)4℃緩慢搖動(dòng)過夜,用TBS-T洗脫后與HRP標(biāo)記的羊抗Rat、羊抗Rabbit以及羊抗Mouse二抗(1：1000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜,化學(xué)發(fā)光顯影,曝光觀察ABCG2、Oct-4蛋白的表達(dá)情況。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,應(yīng)用SPSS 19.0 forWindows統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用t檢測與方差分析。研究結(jié)果：1、人甲狀腺癌中存在著具有干細(xì)胞潛能的側(cè)群細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組(未加入維拉帕米)分選出側(cè)群細(xì)胞含量為1.40%,對照組(加入維拉帕米)分選側(cè)群細(xì)胞含量為0.155%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2、Western blot結(jié)果顯示該側(cè)群細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志0CT4以及腫瘤耐藥基因ABCG2。研究結(jié)論：人甲狀腺癌的起源與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān),并且在甲狀腺癌細(xì)胞株中存在著具有干細(xì)胞特性的甲狀腺癌SP細(xì)胞,該群細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記OCT4及腫瘤耐藥基因ABCG2。因此,甲狀腺癌側(cè)群細(xì)胞可能是甲狀腺癌耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源,提示今后的研究方向是更多是針對該側(cè)群細(xì)胞的靶向治療。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R736.1

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本文編號：1138852