本文關(guān)鍵詞：丹參酮ⅡA聯(lián)合三氧化二砷對NB4細(xì)胞移植瘤裸鼠治療作用的研究

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【摘要】：研究目的丹參酮Ⅱ A聯(lián)合三氧化二砷作用于NB4細(xì)胞移植瘤裸鼠,觀察藥物處理移植瘤裸鼠一定時(shí)間后的作用效果及對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響以及對Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)的影響,了解藥物作用的具體機(jī)制,為丹參酮ⅡA用于治療或輔助治療急性早幼粒細(xì)胞白血病提供依據(jù)。研究方法1.NB4細(xì)胞的培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)在由10%胎牛血清+90% RPMI-1640(含雙抗)組成的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱環(huán)境為：37℃、5%CO2飽和度,每2-3天換液傳代一次,實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對數(shù)生長期細(xì)胞。2.采用皮下接種法構(gòu)建NB4細(xì)胞移植瘤裸鼠動物模型,移植瘤裸鼠通過隨機(jī)的方法分為4組,對照組、30mg/kg Tan ⅡA組、5mg/kg ATO組、聯(lián)合用藥組(30mg/kg Tan ⅡA+5mg/kg ATO),采用剪耳法標(biāo)記裸鼠,于接種后第2天開始給藥,均為腹腔注射,連續(xù)給藥14天。3.給藥期間密切觀察裸鼠成瘤時(shí)間,腫瘤生長特點(diǎn),用游標(biāo)卡尺每2天測量NB4細(xì)胞移植瘤的最大長徑(a)和最小短徑(b),根據(jù)移植瘤體積計(jì)算公式：體積=ab2/2,計(jì)算移植瘤體積,繪制腫瘤生長曲線,測量移植瘤的重量,根據(jù)公式：抑瘤率=(M對照組-M實(shí)驗(yàn)組)/M對照組×100%,計(jì)算藥物抑瘤率。4.移植瘤裸鼠處死后,立即剝離移植瘤組織備用,同時(shí)取裸鼠的肝、脾、雙腎及淋巴結(jié)組織做HE染色,觀察肝、脾、腎臟及淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)是否完整、有無腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。5.采用RT-PCR法檢測各組腫瘤組織mTOR、AKT mRNA的表達(dá)水平,運(yùn)用專業(yè)分析系統(tǒng)ImageJ對RT-PCR條帶光密度進(jìn)行分析,計(jì)算特異目的基因與相應(yīng)內(nèi)參表達(dá)水平比值。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組腫瘤組織Caspase-3、Bax的表達(dá)水平,計(jì)數(shù)一定量的細(xì)胞,根據(jù)陽性細(xì)胞占的百分比和細(xì)胞染色強(qiáng)弱程度進(jìn)行綜合評分,在此次試驗(yàn)中將(+、++、+++)均歸類為蛋白表達(dá)陽性,無分級差別。結(jié)果1.移植瘤成瘤時(shí)間及生長特點(diǎn)將對數(shù)生長期的NB4細(xì)胞(約4×106個(gè)/只,調(diào)整體積為0.2m1)接種于裸鼠左肩甲部皮下,于接種后第7±2天24只裸鼠全部成瘤,出現(xiàn)肉眼可見的瘤塊,成瘤率100%,成瘤后皮下瘤塊生長迅速。2.隨著給藥時(shí)間延長,不同組移植瘤體積增長速度不同,移植瘤增長速度對照組Tan ⅡA組ATO組聯(lián)合用藥組,其不同組隨著給藥時(shí)間的推移移植瘤的生長曲線如圖2,用藥14天后的24小時(shí)內(nèi)處死裸鼠,測量移植瘤的質(zhì)量,對照組、Tan ⅡA組、ATO組、聯(lián)合用藥組移植瘤的質(zhì)量分別為2.82±0.38g、2.68±0.47g、2.38±0.36g、2.12+0.21g,單因素方差分析顯示不同組移植瘤平均質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Tan ⅡA組、ATO組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為4.94%、15.74%、24.80%。3.移植瘤裸鼠淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、腎臟結(jié)構(gòu)完整,體積大小無明顯差異,HE染色發(fā)現(xiàn)裸鼠上述組織無病理改變,未見NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)移。4.采用RT-PCR法檢測mTOR、AKT mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：對照組、Tan ⅡA組、ATO組、聯(lián)合用藥組mTOR mRNA的相對表達(dá)值分別為0.907±0.059、0.883±0.070、0.821±0.039、0.643±0.103, AKT mRNA的相對表達(dá)值分別為0.872±0.075、0.839±0.071、0.776±0.054、0.705±0.060。5.采用免疫組織化學(xué)法法檢測Caspase-3、Bax的表達(dá)結(jié)果顯示：對照組、Tan ⅡA組、ATO組、聯(lián)合用藥組caspase-3陽性表達(dá)數(shù)分別為3(16.7%)、4(22.2%)、9(50.0%)、13(72.2%),Bax陽性表達(dá)數(shù)分別為4(22.2%)、7(38.9%)、12(66.7%)、16(88.9%)。結(jié)論ATO、Tan ⅡA聯(lián)合ATO可抑制移植瘤的生長,Tan ⅡA聯(lián)合ATO用藥作用顯著；Tan ⅡA聯(lián)合ATO可抑制mTOR、AKT mRNA的表達(dá)；Tan ⅡA聯(lián)合ATO通過上調(diào)Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.53

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本文編號：1138939