本文關(guān)鍵詞：MiR-374在間質(zhì)干細(xì)胞突變腫瘤細(xì)胞系形成及遷移中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的前期的研究工作已構(gòu)建r BM-MSC(rat bone marrow mesenchymal stem cell)體內(nèi)突變致瘤模型,并成功分離培養(yǎng)獲得腫瘤細(xì)胞株K3,本研究旨在探討r BM-MSC體內(nèi)惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制。mi RNAs與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān),因此尋找調(diào)控r BM-MSC突變的關(guān)鍵mi RNAs,并根據(jù)其作用靶點(diǎn)確定參與細(xì)胞突變的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法micro RNA芯片篩選rBM-MSC與K3間差異表達(dá)的miRNAs分子,基于文獻(xiàn)報(bào)道與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性和差異明顯兩個(gè)原則選取mi RNAs通過(guò)q RT-PCR驗(yàn)證。對(duì)于確實(shí)上調(diào)/下調(diào)的mi RNAs,分別將相應(yīng)的模擬物及抑制物轉(zhuǎn)染入r BM-MSC,q RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后,生長(zhǎng)曲線、克隆形成、細(xì)胞周期等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力有無(wú)變化,transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后遷移能力的改變,免疫熒光檢測(cè)遷移相關(guān)指標(biāo)E-cadherin,N-cadherin的變化。相反的,將對(duì)應(yīng)的抑制物及模擬物轉(zhuǎn)染入K3觀察其增殖與遷移能力是否與r BM-MSC變化相反。對(duì)于影響細(xì)胞增殖及遷移的mi RNAs,利用靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其下游靶基因,q RT-PCR及熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證其直接靶向作用。Western-blot檢測(cè)mi RNA調(diào)控靶基因的下游蛋白的變化及相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)果經(jīng)篩選和驗(yàn)證r BM-MSC中mi R-374的表達(dá)明顯高于K3,而mi R-199a、mi R-145、mi R-34a、mi R-214、mi R-350的表達(dá)明顯低于K3。r BM-MSC轉(zhuǎn)染mi R-374模擬物后,r BM-MSC平板克隆能力增強(qiáng),細(xì)胞周期S期延長(zhǎng),這些均表明mi R-374高表達(dá)可促進(jìn)r BM-MSC增殖,transwell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)mi R-374的r BM-MSC遷移細(xì)胞數(shù)增多,另外免疫熒光發(fā)現(xiàn)其上皮標(biāo)志E-cadherin減弱,間質(zhì)標(biāo)志N-cadherin增強(qiáng),這一結(jié)果也提示轉(zhuǎn)染后的r BM-MSC遷移能力增強(qiáng)。而在K3轉(zhuǎn)染mi R-374抑制物后,生長(zhǎng)曲線、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示K3增殖水平減低,transwell遷移實(shí)驗(yàn)、E-cadherin、N-cadherin結(jié)果表明遷移能力降低。經(jīng)mi RGen、Target Scan及Pic Tar數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)合與腫瘤相關(guān)性,從mi R-374預(yù)測(cè)的靶基因中篩選獲得wnt5a,雙熒光素酶報(bào)告基因分析、q RT-PCR和western-blot驗(yàn)證了wnt5a是mi R-374的直接靶基因。此外,western-blot顯示wnt5a下游蛋白鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(Ca MKⅡ)和蛋白激酶C(PKC)表達(dá)在mi R-374升高時(shí)均明顯降低。結(jié)論r BM-MSC突變成腫瘤細(xì)胞K3后,mi R-374明顯升高,mi RNA缺失及過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明mi R-374影響r BM-MSC的增殖及遷移,且兩者對(duì)K3增殖與遷移的作用與r BM-MSC相反,功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明mi R-374在r BM-MSC惡性突變中具重要意義。Wnt5a作為mi R-374的靶基因,可通過(guò)活化鈣離子信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的增殖與遷移,而通路中的兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子Ca MKⅡ和PKC均于mi R-374升高時(shí)表達(dá)下降,提示mi R-374通過(guò)wnt5a調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路參與體內(nèi)r BM-MSC突變成瘤。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：1136867