發(fā)布時(shí)間：2017-11-03 08:12

  本文關(guān)鍵詞：肺癌T7噬菌體文庫中MUC1黏蛋白抗原模擬表位的篩選

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【摘要】：背景:作為最常見的癌癥之一,肺癌的發(fā)病率和致死率在全世界范圍內(nèi)均居于各類型癌癥疾病之首,受臨床診斷條件的局限性限制,肺癌患者中,有大約80%的人在確診時(shí)就已處于中、晚期,很容易錯(cuò)過手術(shù)治療和多學(xué)科治療的最佳機(jī)會(huì),甚至經(jīng)過了手術(shù)治療的,術(shù)后5年生存率仍然非常低(15%)。肺部腫瘤臨床上的治療方面,傳統(tǒng)療法多使用放療、化療、手術(shù)治療等,患者要承受巨大的痛苦。腫瘤特異性疫苗治療癌癥,作為傳統(tǒng)療法的一種輔助治療手段,是近年來研究的熱點(diǎn)生物治療方法。其中,以多肽為基礎(chǔ)制備的腫瘤疫苗,成分簡單、易獲得、制備工藝簡潔。模擬表位肽作為天然抗原的低分子模擬物,構(gòu)象上與天然抗原高度相似,能夠在一定程度上誘導(dǎo)天然抗原的特異性體液免疫、特異性細(xì)胞免疫,為腫瘤多肽疫苗的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論根柢。噬菌體表面展示系統(tǒng)優(yōu)勢是庫容大、體積小、可多次擴(kuò)增,因此能夠廣泛應(yīng)用于模擬表位的篩選研究。以單克隆抗體(monoclonal antibody)為篩選配體,對噬菌體展示文庫(Phage Display Library)做淘洗篩選,理論上,可以得到目標(biāo)抗原相對應(yīng)的模擬表位。在我們的這項(xiàng)研究中,使用抗MUC1蛋白的單克隆抗體,作為對肺癌T7噬菌體表面展示文庫(T7 phage library of lung cancer)進(jìn)行生物淘洗的篩選配基,以篩選結(jié)構(gòu)、功能相似的、肺癌特異性的MUC1模擬表位,并探索該表位肽的肺癌特異性及其在臨床診斷和后期疫苗研制中的價(jià)值。方法:1.使用的篩選靶分子是抗MUC1單克隆抗體,淘洗擴(kuò)增后的肺癌T7噬菌體cDNA文庫,進(jìn)行三輪生物淘洗;2.淘洗后得到的噬菌體克隆鋪LB平板測定滴度,并挑取噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增;3.測序并推導(dǎo)陽性噬菌體克隆的氨基酸序列;4.對陽性噬菌體克隆的劑量依賴性以及肺癌特異性進(jìn)行試驗(yàn)檢測,以確定模擬表位在臨床應(yīng)用的價(jià)值。結(jié)果:1.成功地?cái)U(kuò)增了原始的噬菌體文庫,并檢測其滴度,結(jié)果顯示擴(kuò)大培養(yǎng)后的滴度為7×1010pfu/mL,庫容為1.85×106pfu/mL,符合試驗(yàn)中質(zhì)量要求。2.以MUC1單抗為靶分子,淘洗獲得20個(gè)陽性克隆,測序獲得AAPDFRP、SAPDDRP兩種氨基酸序列,對MUC1單抗的抑制率均高于50%,與肺癌患者血清結(jié)合特異性顯著高于與健康人血清結(jié)合特異性(P0.05),認(rèn)為得到的這兩種多肽序列能在一定程度上模擬MUC1抗原的功能。3.模擬出上述兩種多肽序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)論:成功擴(kuò)增肺癌T7噬菌體cDNA文庫,經(jīng)生物淘洗和分析判定,篩選獲得兩種MUC1抗原的模擬表位多肽序列,能夠在一定程度上模擬MUC1抗原的生物功能。MUC1抗原的模擬表位序列豐富了肺癌早期診斷及疫苗研制的抗原種類,提供了一種新型的診斷方法,并為肺癌的臨床早期診斷、治療奠定了一定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 模擬表位 噬菌體文庫 MUC1 生物淘洗
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-16
• 1.1 肺癌10
• 1.2 生物療法用于肺癌治療10-12
• 1.2.1 生物治療10-11
• 1.2.2 模擬表位治療腫瘤11
• 1.2.3 噬菌體展示系統(tǒng)11-12
• 1.3 MUC1黏蛋白12-15
• 1.3.1 MUC1黏蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12-13
• 1.3.2 MUC1黏蛋白與腫瘤治療13-14
• 1.3.3 用于篩選抗原模擬表位14-15
• 1.4 研究目的和意義15-16
• 第2章 MUC1黏蛋白模擬表位的篩選16-25
• 2.1 材料與試劑16-19
• 2.1.1 試驗(yàn)材料16-17
• 2.1.2 主要試劑17
• 2.1.3 試劑配制17-18
• 2.1.4 試驗(yàn)儀器18-19
• 2.2 試驗(yàn)方法19-25
• 2.2.1 噬菌體文庫滴度測定19-20
• 2.2.2 MUC1 抗原模擬表位的篩選20-22
• 2.2.3 模擬表位的特異性檢測22-25
• 第3章 結(jié)果與分析25-38
• 3.1 試驗(yàn)結(jié)果25-34
• 3.1.1 噬菌體文庫擴(kuò)增后滴度25
• 3.1.2 噬菌體文庫的淘洗富集25-27
• 3.1.3 陽性克隆的ELISA分析27
• 3.1.4 陽性克隆的序列分析27-30
• 3.1.5 陽性克隆的特異性檢測30-34
• 3.2 分析與討論34-38
• 3.2.1 試驗(yàn)技術(shù)分析34-36
• 3.2.2 試驗(yàn)結(jié)果討論36-38
• 第4章 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-46
• 致謝46-47
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果47

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1135343