發(fā)布時間：2017-11-03 08:11

  本文關鍵詞：MTDH基因轉染對乳腺癌細胞株MCF-7增殖和紫杉醇敏感性影響的研究

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【摘要】：目的:乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤之一,且乳腺癌發(fā)病呈持續(xù)上升趨勢。乳腺癌的復發(fā)、轉移和多藥耐藥仍是臨床亟待改善和解決的難題。MTDH原癌基因增強腫瘤細胞的增殖及抗凋亡能力,促進腫瘤新血管生成,并與腫瘤細胞侵襲、擴散、轉移及化療耐藥相關。本實驗研究MTDH高表達對乳腺癌MCF-7細胞增殖及對紫杉醇耐藥性的影響。方法:1慢病毒介導MTDH高表達的MCF-7穩(wěn)轉細胞株的構建和鑒定:MTDH基因表達質粒,經大腸桿菌轉化擴增,提取純化后送測序鑒定。測序成功后使用慢病毒感染MCF-7細胞,通過綠色熒光蛋白GFP檢測轉染效率。使用嘌呤霉素進行加壓篩選,獲得穩(wěn)定高表達MTDH基因的新的乳腺癌細胞株(命名為MCF-7-MTDH)和陰性對照病毒穩(wěn)定轉染的乳腺癌細胞株(命名為MCF-7-vector)。采用RT-PCR方法分別檢測空白對照組(MCF-7細胞)、陰性對照組(MCF-7-vector細胞)、實驗組(MCF-7-MTDH細胞)的MTDH m RNA表達水平驗證轉染效果。2 CCK法檢測細胞增殖及對紫杉醇的敏感性:以MCF-7作為空白對照,以MCF-7-vector作為陰性對照,檢測MTDH高表達對MCF-7細胞增殖和對紫杉醇藥物敏感性的影響。3流式細胞術檢測細胞周期及紫杉醇對細胞周期的影響:以MCF-7作為空白對照,以MCF-7-vector作為陰性對照,檢測MTDH高表達對細胞周期的影響,并檢測紫杉醇藥物對細胞周期的影響。4統計分析:每組實驗至少有3個獨立樣本的重復,應用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行統計分析。數據用均數±標準差(x±s)表示,進行t檢驗(t-test)、單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)或非參數檢驗(Nonparametric test),檢驗以P0.05為差異有顯著性意義。結果:1慢病毒介導高表達MTDH乳腺癌穩(wěn)轉細胞株的構建和鑒定MCF-7細胞MOI值檢測:顯微鏡下觀察慢病毒感染后細胞綠色熒光蛋白GFP表達情況,實驗結果顯示乳腺癌MCF-7細胞的MOI(Multiplicity Of Infection,MOI)值為20,即細胞感染效率達到80%,且細胞形態(tài)在感染前后無明顯改變。高表達MTDH的MCF-7穩(wěn)轉細胞株的構建與鑒定:慢病毒感染MCF-7細胞72h后,通過熒光顯微鏡觀察MCF-7-MTDH實驗組和MCF-7-vector對照組均可見綠色熒光蛋白表達,轉染效率都超過80%。經嘌呤霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定轉染的MCF-7-MTDH細胞株和MCF-7-vector細胞株。通過RT-PCR檢測MCF-7細胞、MCF-7-vector細胞、MCF-7-MTDH細胞中MTDH基因m RNA表達水平分別為1.000±0.100、1.013±0.169、2.093±0.055。統計分析結果顯示MCF-7細胞與MCF-7-vector細胞MTDH基因m RNA表達未見明顯差異(P0.05),MCF-7-MTDH細胞MTDH基因m RNA表達高于MCF-7細胞、MCF-7-vector細胞,差異有統計學意義(P0.05)。2 MTDH高表達對細胞增殖和細胞周期的影響將MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三種細胞分別作為空白對照組、陰性對照組和實驗組。CCK法檢測各組細胞于0h、24h、48h、72h的增殖情況,統計分析顯示空白與陰性對照兩組細胞增殖未見明顯差異(P0.05),實驗組MCF-7-MTDH細胞增殖快于對照兩組,差異有統計學意義(P0.01)。流式細胞儀檢測各組的細胞周期,結果顯示空白對照組、陰性對照組、實驗組細胞G0/G1期的比例分別為32.90±1.48%、34.70±1.65%、28.80±1.21%;S期比例分別為43.40±0.95%、40.37±3.61%、57.60±2.10%;G2/M期的比例分別為23.67±0.80%、23.60±2.51%、13.57±2.11%。統計分析結果顯示空白及陰性對照組的細胞周期無顯著差異(P0.05),而與對照對相比實驗組細胞S期延長,G0/G1期和G2/M期縮短(P0.05)。3紫杉醇對轉染前后乳腺癌細胞增殖和周期的影響將MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三種細胞分別作為空白對照組、陰性對照組和實驗組。CCK法檢測1ug/ml紫杉醇作用24h對三組細胞的抑制率分別為63.71±0.31%、64.15±0.17%、45.72±0.41%;1ug/ml紫杉醇作用48h對三組細胞的抑制率分別為37.46±0.17%、37.10±0.14%、25.90±0.31%;10 ug/ml紫杉醇作用24h對三組細胞的抑制率分別為71.11±0.87%、72.55±0.68%、66.97±0.84%;10 ug/ml紫杉醇作用48h對三組細胞的抑制率分別為69.95±0.43%、70.77±0.21%、59.95±0.53%,統計分析結果顯示在藥物濃度、作用時間都相同條件下空白及陰性對照組的紫杉醇抑制率未見明顯差異(P0.05)。1ug/ml、10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后對實驗組MCF-7-MTDH細胞的抑制率均低于兩對照組,差異有統計學意義(P0.05)。空白對照組細胞10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后抑制率未見明顯差異(P0.05),其余各組紫杉醇作用48h后抑制率較24h降低,差異有統計學意義(P0.05)。流式細胞儀檢測紫杉醇用藥后各組的細胞周期,統計分析結果顯示:紫杉醇藥物誘導各組細胞G2/M期比例增高,10ug/ml用藥組較1ug/ml用藥組增高更加明顯(P0.05);藥物濃度相同的情況下,MCF-7、MCF-7-vector細胞的G2/M期比例無顯著差異(P0.05),而MCF-7-MTDH細胞的G2/M期比例低于MCF-7、MCF-7-vector細胞,有顯著性差異(P0.05)。結論:1通過慢病毒介導成功的構建MTDH高表達穩(wěn)定轉染MCF-7細胞株。2 MTDH高表達可促進乳腺癌MCF-7細胞增殖。3 MTDH高表達可促使乳腺癌MCF-7細胞G2/M期比例下調,降低細胞對紫杉醇的敏感性。
【關鍵詞】：乳腺癌 MTDH 細胞增殖 紫杉醇 藥物敏感性
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-24
• 結果24-26
• 附圖26-31
• 附表31-34
• 討論34-37
• 結論37-38
• 參考文獻38-41
• 綜述 腫瘤耐藥及MTDH介導耐藥機制的相關研究41-54
• 參考文獻49-54
• 致謝54-55
• 個人簡歷55

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前4條

1 張珂;張霞;孫彩萍;胡濱;;多藥耐藥相關蛋白2基因在COC1/DDP細胞對順鉑耐藥中的作用[J];腫瘤基礎與臨床;2015年05期

2 陳萬青;鄭榮壽;;中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J];中國腫瘤臨床;2015年13期

3 張華耀;劉建平;蘇正;楊尚霖;韋金星;汪洋;;多藥耐藥相關蛋白4在肝癌細胞株SMMC-7721中化療耐藥的作用[J];中華實驗外科雜志;2015年03期

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本文編號：1135337