本文關鍵詞：結直腸癌干細胞源性exosomes分離鑒定及其免疫學性質的研究

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【摘要】：結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤,在西方國家中其發(fā)病率和致死率分別位于第三位和第二位。目前,對于結直腸癌的治療還是以手術切除結合化學治療或者放射線治療為主。然而,該治療方法雖然可以在一定程度上控制疾病的惡化,但是并不能徹底的治愈結直腸癌。因此,探索治療結直腸癌的新方法成為該領域亟待解決的科學問題。腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSCs)具有和成體干細胞相似的自我更新和分化的能力。腫瘤干細胞假說認為,CSCs是腫瘤發(fā)生、轉移和復發(fā)的基礎。所以,以結直腸癌干細胞(Colorectal cancer stem cells,CR-CSCs)為靶點的研究為結直腸癌的治療提供了新思路。Exosomes(EXO)是由細胞分泌的一種具有雙層膜結構的小囊泡,其攜帶的蛋白質組分與母體細胞具有高度的相似性。腫瘤細胞來源的EXO會攜帶腫瘤表面抗原。近些年,關于腫瘤細胞來源的EXO作為腫瘤疫苗的相關研究以后較多報道。但是,關于CSCs來源EXO的免疫學相關研究相關報道較少。腫瘤細胞來源的EXO本身免疫原性較低,如何提高EXO的免疫原性成為該領域研究的難點。因此,提高CR-CSCs來源EXO的免疫原性對于結直腸癌的預防和治療具有重要意義。本課題通過免疫磁珠法(Magnetic activated cell sorting,MACS)從培養(yǎng)的結直腸癌細胞系CT-26中分離CR-CSCs,通過形態(tài)觀察、特異性標記檢測及多能性基因的表達對CR-CSCs進行形態(tài)、表型和多能性的鑒定。利用沉淀劑從正常培養(yǎng)的CR-CSCs上清和熱休克(Heat shock,HS)處理的上清中分離EXO,通過掃描電子顯微鏡觀察和特異性標記檢測,對分離的EXO進行形態(tài)和表型的鑒定。通過EXO與外周血單核淋巴細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)共培養(yǎng)實驗,分析EXO對PBMCs的增殖能力、分泌能力和殺傷能力影響,并通過免疫印跡檢測EXO中免疫相關分子的表達變化。最后,利用體內實驗評價EXO的免疫預防作用和免疫治療作用。體外實驗結果表明:分離培養(yǎng)的CR-CSCs具有正常表型,并且能夠成球形生長,此外,CR-CSCs能夠表達多能性基因Sox2、Oct4和Nanog;熱休克處理后的EXO(HS-EXO)仍然具有正常的形態(tài)和表面標記;在HS-EXO的刺激下,PBMCs的增殖能力和殺傷能力得到顯著提高(P0.05),并且能夠顯著促進IFN-γ和IL-2的分泌(P0.05)及免疫相關分子HSP60、HSP90、HLA-1和ICAM-1的表達。體內實驗結果表明:分離培養(yǎng)的CR-CSCs具有非常強的成瘤能力,接種13d后,PBS對照組所有小鼠全部長有腫瘤;經(jīng)過HS-EXO和EXO免疫預防的小鼠腫瘤開始生長的時間明顯延后,最后未長腫瘤小鼠數(shù)量顯著低于PBS對照組(P0.001),而HS-EXO的預防效果在一定程度上優(yōu)于EXO,但兩者并沒有顯著差異;經(jīng)過HS-EXO和EXO免疫治療后,兩組腫瘤生長的速度明顯降低,未生長腫瘤小鼠的數(shù)量和小鼠的生存率顯著高于對照組(P0.001),HS-EXO的治療效果顯著的優(yōu)于EXO,兩組未生長腫瘤小鼠數(shù)量存在顯著差異(P0.05)綜上所述,本課題以EXO為研究核心,以CR-CSCs為研究基礎,探索熱休克處理對CR-CSCs來源EXO的免疫學性質的影響。我們研究發(fā)現(xiàn)熱休克處理沒有影響EXO的基本性質,同時,可以提高EXO內HSP和免疫相關蛋白的表達,進而提高EXO的免疫原性,提高EXO的免疫預防功能和免疫治療功能,為EXO疫苗的臨床應用提供一定的科學數(shù)據(jù)。
【關鍵詞】：結直腸癌 腫瘤干細胞 Exosomes 熱休克 免疫治療
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 中英文對照9-13
• 第1章 緒論13-25
• 1.1 腫瘤干細胞的研究進展13-17
• 1.1.1 腫瘤干細胞起源13-14
• 1.1.2 腫瘤干細胞表面標記14-16
• 1.1.3 腫瘤干細胞免疫逃避16-17
• 1.2 結直腸癌干細胞的研究進展17-20
• 1.2.1 結直腸癌干細胞的起源17-19
• 1.2.2 結直腸癌干細胞的識別19-20
• 1.3 Exosomes的研究進展20-22
• 1.3.1 Exosomes的組成21
• 1.3.2 腫瘤細胞來源exosomes的免疫調節(jié)功能21-22
• 1.4 熱休克蛋白22-23
• 1.5 立題依據(jù)23-25
• 第2章 材料和方法25-36
• 2.1 實驗動物25
• 2.2 實驗材料25-28
• 2.2.1 實驗儀器25-26
• 2.2.2 實驗試劑26-27
• 2.2.3 引物27
• 2.2.4 細胞系27-28
• 2.3 實驗方法28-36
• 2.3.1 購買CT-26的處理28
• 2.3.2 CT-26的凍存保種28
• 2.3.3 CT-26腫瘤干細胞的分離培養(yǎng)28-29
• 2.3.4 RNA的分離和提取29-30
• 2.3.5 RNA的反轉錄30-31
• 2.3.6 PCR31
• 2.3.7 免疫印跡31-32
• 2.3.8 免疫組織化學32
• 2.3.9 腫瘤干細胞的熱休克處理32
• 2.3.10 Exosomes的分離32-33
• 2.3.11 Exosomes形態(tài)學鑒定33
• 2.3.12 Exosomes特異性標記的鑒定33
• 2.3.13 PBMCs的分離33-34
• 2.3.14 PBMCs的增殖實驗34
• 2.3.15 Exosomes對PBMCs因子分泌的影響34
• 2.3.16 PBMCs對腫瘤干細胞的殺傷作用34-35
• 2.3.17 Exosomes的免疫保護實驗35
• 2.3.18 Exosomes的免疫治療實驗35-36
• 第3章 實驗結果36-48
• 3.1 腫瘤干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定36-39
• 3.1.1 CT-26細胞的培養(yǎng)36
• 3.1.2 CT-26腫瘤干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定36-39
• 3.2 結直腸癌干細胞源性Exosomos的分離和鑒定39-40
• 3.3 Exosomes在體外對PBMCs增殖和因子分泌的影響40-43
• 3.4 Exosomes作為疫苗的抗腫瘤效應43-48
• 第4章 結論48-49
• 第5章 討論49-53
• 參考文獻53-59
• 致謝59

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