本文關(guān)鍵詞：VPS33B抑制肺癌細胞增殖，遷移和侵襲

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【摘要】：研究背景原發(fā)性支氣管肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,也是全球與癌癥相關(guān)死亡率最高的癌癥之一,它原發(fā)于支氣管黏膜和肺泡。現(xiàn)在研究認為導(dǎo)致肺癌的主要原因與吸煙、環(huán)境嚴重污染和氡暴露等有關(guān)。在全球男性癌癥患者中肺癌是最主要的死亡原因,而在發(fā)展中國家肺癌也成為了女性癌癥患者中僅次于宮頸癌的第二大死亡因素。全球每年超過100萬人死于肺癌并且肺癌的死亡率仍然在以每年1-5%的速度逐年遞增,在發(fā)展中國家中這一趨勢尤為突出,我國肺癌發(fā)病率和死亡率仍呈迅速上升的趨勢,每年發(fā)病率約增長26.9%。由于肺癌在早期起病隱匿,癥狀不明顯,當發(fā)現(xiàn)并診斷為肺癌時已經(jīng)處于疾病進展期,大部分肺癌患者在得到明確診斷以前已經(jīng)開始出現(xiàn)侵襲及轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,盡管經(jīng)過幾十年對肺癌發(fā)病機制的不斷研究,現(xiàn)在也已產(chǎn)生多種治療肺癌的方法,但目前肺癌的5年生存率仍然小于15%,因此提高肺癌的存活率已成為當前最緊迫的目標也是最艱難的挑戰(zhàn)。根據(jù)組織學(xué)分類,肺癌現(xiàn)在主要分為兩大類：小細胞肺癌和非小細胞肺癌,其中約15%的肺癌患者屬于小細胞肺癌,非小細胞肺癌大約占85%的比例。目前非小細胞肺癌主要的治療方式包括手術(shù)、化療、放療。隨著分子生物研究的深入發(fā)展促進了驅(qū)動突變的癌基因的發(fā)現(xiàn),使生物治療成為口服藥物的后續(xù)發(fā)展。根據(jù)驅(qū)動癌基因突變的分子機制的不同將非小細胞肺癌分為不同的分子類型并針對不同分子類型產(chǎn)生了新的治療方式,由此顯著改變了肺癌的歷史地位。在非小細胞肺癌里現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的主要驅(qū)動突變基因包括EGFR、EML-4/ALK、KRAS、HER2、PIK3CA、BRAF、MET基因突變和ALK、 ROS1和RET基因重排,腫瘤的EGFR和ALK基因檢測正逐步成為常規(guī)檢測項目,而針對這些突變基因的靶向治療藥物已不斷被研發(fā)出來,甚至大部分靶向藥物已應(yīng)用于臨床,明顯改善了非小細胞肺癌患者的預(yù)后。然而大部分患者在使用這些靶向治療藥物1年后可能就會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,因此新的驅(qū)動突變基因的發(fā)現(xiàn)有助于非小細胞肺癌的進一步治療。VPS33B基因官方名稱Vacuolar protein sorting 33 homologB(yeast),表達的蛋白叫做空泡蛋白分選蛋白(Vacuolar protein sorting-associated protein 33B),屬于Secl/Munc-18(SM)蛋白家族成員之一,大鼠VPS33B基因的人類同源基因,編碼區(qū)全長1854bp,編碼617個氨基酸,分子量大小71kd。sec-1結(jié)構(gòu)域蛋白的作用主要是參與蛋白的排序與液泡轉(zhuǎn)運,將細胞內(nèi)的小分子分類運輸?shù)较鄳?yīng)的靶器官進而使其在體內(nèi)發(fā)揮作用。目前有關(guān)VPS33B基因的報道主要集中在關(guān)節(jié)攣縮、腎功能不全和膽汁淤積綜合征(ARC syndrome)和巨核細胞與血小板a-顆粒的生物合成等疾病上,尚未見其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系方面的報道。研究目的1.研究VPS33B在癌旁肺組織和肺癌組織以及肺癌細胞中的表達特性；2.研究VPS33B對肺癌細胞增殖能力的影響；3.研究VPS33B對肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響。研究內(nèi)容和方法1.鑒定VPS33B在癌旁肺組織和肺癌組織以及肺癌細胞中的表達特性1)利用免疫組化和RT-PCR檢測肺癌組織和癌旁肺組織中VPS33B的表達情況；2) 利用Western blot檢測VPS33B在肺癌細胞株中的蛋白質(zhì)表達水平,并篩選表達量低的兩株肺癌細胞用于后續(xù)實驗。2. VPS33B在體內(nèi)外對肺癌細胞增殖能力的影響及分子機制1) 利用公司包裝的慢病毒轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞株A549和H1975,建立穩(wěn)定過表達VPS33B基因的肺癌細胞株；化學(xué)合成靶向VPS33B的siRNA干擾片段,瞬時干擾過表達VPS33B基因的肺癌細胞株；利用熒光定量PCR和Western blot進行VPS33B基因過表達的鑒定以及各干擾細胞中VPS33B基因干擾效率的鑒定,以其中干擾效率最高的一個做為下一步實驗的研究對象；2)構(gòu)建穩(wěn)定過表達和瞬時干擾VPS33B的肺癌細胞株前后,MTT分別檢測處理組和對照組中細胞活性的變化；3)穩(wěn)定過表達和瞬時干擾VPS33B前后,平板克隆檢測處理組和對照組中細胞增殖能力的變化；4)EDU實驗檢測穩(wěn)定過表達和瞬時干擾VPS33B前后處于S期細胞比例在處理組和對照組間的差異；5)流式細胞儀檢測穩(wěn)定過表達和瞬時干擾VPS33B前后,細胞各周期分布在處理組和對照組間的差異；6) 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測穩(wěn)定過表達VPS33B前后,細胞活體內(nèi)致瘤能力的變化,并將瘤子取出進行組織切片行免疫組化檢測,觀察相關(guān)蛋白表達量的變化；7) 利用Western blot檢測穩(wěn)定過表達VPS33B后,與細胞周期進展相關(guān)的重要蛋白的變化,探索VPS33B調(diào)控細胞周期相關(guān)的信號通路。3. VPS33B在體外對肺癌細胞遷移以及侵襲能力的影響及分子機制1) Transwell和Boyden實驗檢測穩(wěn)定過表達和瞬時干擾VPS33B前后,處理組和對照組細胞間遷移和侵襲能力的改變；2) Western blot實驗檢測穩(wěn)定過表達VPS33B后,細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白是否發(fā)生變化,從而探索VPS33B調(diào)控細胞遷移和侵襲的主要信號通路。4.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果用x±s表示。熒光定量PCR結(jié)果中各細胞樣本的2-△△Ct值的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若有統(tǒng)計學(xué)差異,多重比較間采用Dunnett法；EDU實驗,平板克隆實驗,細胞周期實驗以及Transwell和Boyden等兩組間實驗結(jié)果比較采用兩獨立樣本t檢驗；四格表x2檢驗用于兩組間率的比較：P0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.VPS33B在肺癌及癌旁肺組織的表達情況以及臨床意義在熒光定量PCR的實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)VPS33B mRNA在肺癌組織和癌旁肺組織的表達水平明顯不同,具有顯著性差異：免疫組化結(jié)果提示VPS33B的表達主要定位于細胞漿中,在肺癌組織和癌旁肺組織的表達水平也明顯不同,差異具有顯著性,以上兩種實驗檢測結(jié)果具有一致性。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)VPS33B蛋白的表達水平與肺癌患者的臨床分期相關(guān)性密切,即VPS33B表達越強,臨床分期則越早；而VPS33B表達越弱或呈陰性表達,臨床分期則越晚；Western blot實驗表明VPS33B在肺癌細胞中的表達均偏低,其中A549和H1975兩株細胞株表達量最低,因此選作后續(xù)實驗。2. VPS33B在肺癌中抑制肺癌細胞在體內(nèi)外的增殖及其分子機制1)慢病毒轉(zhuǎn)染A549、H1975細胞株構(gòu)建穩(wěn)定過表達VPS33B的細胞株,熒光定量PCR以及Western blot實驗結(jié)果表明成功建立了穩(wěn)定過表達VPS33B的肺癌細胞株；2)MTT法檢測過表達VPS33B基因后肺癌細胞體外的增殖情況,與A549-NC和H1975-NC細胞組相比,A549-VPS33B和H1975-VPS33B細胞的增殖速度明顯減慢,并表現(xiàn)出時間依賴性關(guān)系；平板克隆形成實驗顯示A549-VPS33B和H1975-VPS33B細胞的體外增殖能力較對照組顯著下降；EDU實驗顯示A549-VPS33B和H1975-VPS33B細胞中處于S期的比例較對照組減少,細胞的增殖能力減弱；流式細胞術(shù)檢測的各組肺癌細胞周期的結(jié)果表明A549-VPS33B和H1975-VPS33B相對于對照組細胞的G1期比率有所增加,S期比率則明顯減少,該實驗結(jié)果提示過表達VPS33B后細胞增殖周期延緩；以上所有實驗結(jié)果均表明過表達VPS33B后,肺癌細胞在體外的生長被顯著抑制；3)將過表達VPS33B基因的實驗組肺癌細胞和對照組肺癌細胞分別接種于裸鼠皮下,通過連續(xù)2-3周的觀察,我們發(fā)現(xiàn)過表達VPS33B基因的肺癌細胞組相對于對照組顯示出了顯著抑制肺癌細胞體內(nèi)增殖的能力。待瘤子長至一定大小在發(fā)生壞死前將其剝出測量提示,A549-VPS33B和H1975-VPS33B細胞皮下成瘤重量較對照組更輕且體積較對照組生長更��；4) Western blot實驗檢測過表達VPS33B基因后與細胞周期相關(guān)的重要基因的表達變化,實驗結(jié)果表明C-myc, CDK6, CCND1, p-Rb and E2F1表達下調(diào),P16表達上調(diào)。同時檢測了,p-AKT,AKT,p-PI3K和P13K的表達,發(fā)現(xiàn)AKT, PI3K,PTEN表達不變,p-AKT and p-PI3K的表達下調(diào)。3. VPS33B在肺癌中抑制肺癌細胞在體外的遷移和侵襲能力及其分子機制1) Transwell和Boyden實驗結(jié)果表明穩(wěn)定過表達VPS33B后,肺癌細胞在體外的遷移和侵襲能力明顯被抑制,表明VPS33B可以抑制肺癌細胞遷移和侵襲；2)穩(wěn)定過表達VPS33B后,我們利用Western blot檢測了與遷移和侵襲相關(guān)的重要調(diào)控因子的變化情況,發(fā)現(xiàn)Snail、N-cadherin和Vimentin表達下調(diào),而E-cadherin表達上調(diào)。4.瞬時干擾VPS33B表達后對肺癌細胞生物學(xué)功能的改變利用陽離子脂質(zhì)體將化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染至肺癌細胞A549-VPS33B和H1975-VPS33B后利用熒光定量PCR和western blot檢測其干擾效率,結(jié)果顯示設(shè)計合成的3對siRNA序列中,三個干擾片段的干擾效率一致且干擾效率均在90%以上,以其中任意一個片段作為后續(xù)功能實驗研究對象。MTT, EDU實驗檢測干擾VPS33B過表達前后細胞增殖的變化,結(jié)果表明干擾VPS33B過表達后肺癌細胞的增殖能力恢復(fù)；Transwell和Boyden實驗結(jié)果表明瞬時干擾VPS33B過表達后,肺癌細胞在體外的遷移和侵襲能力恢復(fù)。以上實驗再次從反面證明了VPS33B可以抑制肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移、侵襲能力。結(jié)論：1.VPS33B與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；2.VPS33B可以抑制肺癌細胞的增殖；3.VPS33B可以抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 VPS33B 基因 增殖 遷移 侵襲 分子機制
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-23
• 參考文獻19-23
• 第一章 肺癌細胞株及肺癌組織中VPS33B表達特性的鑒定23-39
• 一、材料與方法23-32
• 二、結(jié)果32-35
• 三、討論35-36
• 參考文獻36-39
• 第二章 VPS33B基因抑制肺癌細胞增殖及其分子機制39-57
• 一、材料和方法39-46
• 二、結(jié)果46-51
• 三、討論51-55
• 參考文獻55-57
• 第三章 VPS33B基因抑制肺癌細胞遷移和侵襲及分子機制57-68
• 一、材料和方法57-60
• 二、結(jié)果60-63
• 三、討論63-65
• 參考文獻65-68
• 全文小結(jié)68-70
• 致謝70-72

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本文編號：1127357