本文關(guān)鍵詞：miR-128a在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制的探討

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【摘要】：研究背景及目的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年增長,已超過74.8萬/年,居于惡性腫瘤的第5位;死亡接近70萬/年,位居腫瘤相關(guān)死亡的第2位。世界上一半以上的肝癌新發(fā)病例發(fā)生在中國。在我國大多數(shù)肝癌患者起病隱匿,早期幾乎無明顯癥狀,但病情進展迅速,確診時大多數(shù)患者已經(jīng)達到局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,治療困難且預(yù)后很差。目前雖然在早期診斷、肝移植和早期肝癌切除術(shù)方面取得了重要進展,但HCC卻是僅次于肺癌的第二大癌癥殺手。因此,肝癌嚴重危害我國人民的健康和生命。越來越多的研究表明：肝癌的發(fā)生發(fā)展是一系列復(fù)雜、多步驟的連續(xù)過程。其中抑癌基因與癌基因表達失調(diào)是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要一環(huán),如抑癌基因TP53、AXIN1/2、APC、PTEN等的失活或表達量降低以及癌基因β-catenin、 TGF-β、c-myc等的激活或表達量的增加與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然如此,這些基因卻還不能作為肝癌早期診斷和預(yù)后判斷有效的分子標志物。因此,尋找可以輔助肝癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、精準治療及判斷預(yù)后的分子標志物以及研究肝癌發(fā)病的分子機制仍是肝癌研究的重要內(nèi)容。MicroRNAs(miRNAs)是一群高度保守的小片段非蛋白編碼RNA分子,長度為18至25個核苷酸,在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明miRNAs在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用,miRNAs通過與其靶基因相互作用在機體內(nèi)組成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對生物體的生長、發(fā)育、分化、增殖、凋亡、免疫活動和疾病發(fā)生過程等進行精確調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNAs的突變或失調(diào)與人類多種腫瘤相關(guān),這些差異表達的miRNAs調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達,參與細胞分化、增殖、細胞凋亡和血管生成等生物學過程的調(diào)控,可能代表腫瘤的生物特性的改變,而且差異表達miRNAs可作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的分子標志物。微RNA-128 (miR-128)是一種在正常腦神經(jīng)系統(tǒng)中高表達的miRNA,在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常生理功能的維持中發(fā)揮重要作用。有研究顯示,miR-128在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤中表達下調(diào),并通過其靶基因如促癌基因Bmi-1,EGFR,p70S6K1, E2F3a等發(fā)揮抑癌作用。近年研究證實,miR-128的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),miR-128在多種腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。其表達的失調(diào)還與骨肉瘤、直腸癌等腫瘤患者的臨床預(yù)后相關(guān),并與宮頸癌患者對順鉑化療耐藥情況相關(guān)。而在膠質(zhì)瘤中,miR-128可促進腦膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療敏感性增加。上述的研究結(jié)果預(yù)示著miR-128可能成為具有潛在價值的重要腫瘤標志物,與腫瘤診斷、治療和預(yù)后相關(guān),并有望成為腫瘤治療的新靶點。本研究首先應(yīng)用qRT-PCR方法檢測miR-128a在肝細胞癌組織和對應(yīng)癌旁組織中的表達水平的變化。然后通過MTT方法檢測經(jīng)miR-128a mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染后肝癌細胞增殖活力變化,探討miR-128a在肝癌細胞中的生物學功能,進而通過軟件預(yù)測、雙熒光素酶試驗、qRT-PCR及Western blot闡明了其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機制。最后應(yīng)用qRT-PCR方法檢測62例肝癌組織中miR-128a的表達,分析其表達與肝癌預(yù)后、臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系,明確miR-128a能否成為判斷肝癌預(yù)后的分子靶標,為進一步尋找肝癌早期診斷、預(yù)后判斷、確定治療決策的新的分子標志物及靶向治療提供了理論依據(jù)。方法1、肝癌組織及對應(yīng)癌旁組織中miR-128a表達水平的分析利用qRT-PCR方法檢測來自19例患者的肝癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中miR-128a的表達水平。采用配對t檢驗的方法比較肝癌組織及其癌旁組織中miR-128a的表達水平有無差異。所有肝癌組織均為術(shù)后新鮮標本,診斷經(jīng)病理證實。2、miR-128a在肝癌細胞中的生物學功能及其促進肝癌細胞增殖的作用機制運用陽離子脂質(zhì)體LipofectaminTM RNAiMAX介導(dǎo)miR-128a inhibitor或mimic轉(zhuǎn)染肝癌細胞株,然后采用TRizol法提取肝癌細胞RNA,并采用qRT-PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)染后miR-128a在肝癌細胞中的表達；接著利用MTT法測定轉(zhuǎn)染前后肝癌細胞增殖能力的變化。最后我們用TargetScan Human6.2,miRanda, PicTar等公用在線軟件對miR-128a的靶基因進行預(yù)測,選出兩個以上軟件同時預(yù)測到的靶基因,結(jié)合miR-128a促進肝癌細胞增殖的生物學功能,選出miR-128a可能的靶基因RND3,采用雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)驗證miR-128a和RND3之間相互作用。并在肝癌細胞中過表達或干擾miR-128a后,利用qRT-PCR及Western blot方法檢測RND3及凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化。3、miR-128a表達水平在肝癌中的作用意義利用qRT-PCR方法檢測62例肝癌石蠟組織標本中]miR-128a的表達水平,應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析法分析miR-128a對肝癌預(yù)后的影響；采用Spearman秩相關(guān)分析miR-128a表達與肝癌各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性；運用COX比例風險回歸模型對各臨床病理參數(shù)、miR-128a表達與肝癌預(yù)后的關(guān)系進行單因素與多因素分析,明確miR-128a是否可以作為肝癌發(fā)病的獨立風險因素。結(jié)果1、肝癌組織及對應(yīng)癌旁組織中miR-128a表達水平的分析我們用qRT-PCR方法檢測了在19對肝癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中miR-128a的表達水平,采用配對t檢驗的方法比較肝癌及其對應(yīng)癌旁組織miR-128a的表達水平有無差異。結(jié)果表明肝癌組織中miR-128a表達水平高于肝癌癌旁組織中miR-128a表達水平,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、miR-128a在肝癌細胞中的生物學功能及其促進肝癌細胞增殖的作用機制采用miR-128a mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染肝癌細胞后,運用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果提示肝癌細胞miR-128a表達水平在轉(zhuǎn)染miR-128a mimic組中相應(yīng)升高,而在轉(zhuǎn)染miR-128a inhibitor組中相應(yīng)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；運用MTT法檢測肝癌細胞增殖能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中miR-128a過表達后,肝癌細胞的增殖能力明顯增加,相反當對肝癌細胞miR-128a干擾表達后,肝癌細胞的增殖能力下降(P0.001)。接著用TargetScan Human 6.2,miRanda和Pic Tar等公用在線軟件對miR-128a的靶基因進行預(yù)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在TargetScan Human6.2和miRanda兩個軟件中可同時預(yù)測到RND3 3'UTR區(qū)存在與miR-128a的保守作用位點。我們進一步應(yīng)用雙熒光素酶基因報告試驗進行驗證miR-128a與RND3 3'UTR之間的相互作用,結(jié)果表明,在RND3 3'UTR野生型組中,轉(zhuǎn)染了miR-128a的肝癌細胞的熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染nc組肝癌細胞的熒光素酶活性降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。而在RND3 3'UTR突變型組中無明顯變化。這些結(jié)果證明miR-128a可直接作用于RND3 3'UTR區(qū)。另外,在肝癌細胞中過表達miR-128a后,RND3 mRNA水平及蛋白水平均相應(yīng)減少,而在肝癌細胞中干擾miR-128a表達后,RND3 mRNA水平及蛋白水平均相應(yīng)增加,這進一步證實miR-128a靶向調(diào)控RND3促進肝癌細胞增殖。我們在肝癌細胞中抑制miR-128a表達后,采用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)cyclin B1,cyclin D1和CDK4的表達下調(diào),這些結(jié)果提示miR-128a促進肝癌細胞增殖可能是通過靶向調(diào)控RND3進而影響細胞周期進展來實現(xiàn)的。3、miR-128a在肝癌中作用意義我們應(yīng)用qRT-PCR方法檢測了62例肝癌石蠟標本中miR-128a的表達情況,再應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析miR-128a的表達情況與肝癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-128a表達只與AST密切相關(guān),而與性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、肝癌巴塞羅那分期、門脈癌栓、腫瘤數(shù)目、遠處轉(zhuǎn)移、血清AFP、肝硬化、HBS-Ag、ALT、ALB及腫瘤復(fù)發(fā)均無顯著相關(guān)性。生存分析發(fā)現(xiàn)無論肝癌患者有無復(fù)發(fā),miR-128a的表達均未發(fā)現(xiàn)與肝癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。COX比例風險回歸模型對各臨床病理參數(shù)、miR-128a表達與肝癌預(yù)后的關(guān)系進行單因素與多因素分析,只發(fā)現(xiàn)AST及肝癌巴塞羅那分期為肝癌的危險因素。結(jié)論1、miR-128a在肝癌組織中的表達普遍增高,可作為診斷肝癌的一個有價值的分子標志物。2、miR-128a在肝癌細胞中可以通過靶向調(diào)控RND3促進肝癌細胞增殖。3、miR-128a在肝癌中高表達,但尚未發(fā)現(xiàn)其與肝癌患者預(yù)后及臨床病理特征相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 miR-128a RND3 細胞增殖
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-21
• 參考文獻18-21
• 技術(shù)路線21-23
• 第一章 miR-128a在肝癌中的表達情況23-35
• 第一節(jié) 實驗材料、試劑和主要設(shè)備24-25
• 第二節(jié) 實驗方法25-29
• 第三節(jié) 結(jié)果29-31
• 第四節(jié) 討論31-32
• 參考文獻32-35
• 第二章 探討miR-128a在肝癌中的生物學功能及其作用機制35-64
• 第一節(jié) 實驗材料、試劑和主要設(shè)備35-36
• 第二節(jié) 實驗方法36-51
• 第三節(jié) 結(jié)果51-60
• 第四節(jié) 討論60-62
• 參考文獻62-64
• 第三章 探討miR-128a在肝癌中的臨床意義64-78
• 第一節(jié) 實驗材料、試劑和主要設(shè)備64-67
• 第二節(jié) 實驗方法67-70
• 第三節(jié) 結(jié)果70-74
• 第四節(jié) 討論74-75
• 參考文獻75-78
• 全文討論78-83
• 參考文獻80-83
• 全文小結(jié)83-84
• 縮略語中英文對照84-85
• 讀碩士期間成果85-86
• 致謝86-88

【共引文獻】

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本文編號：1124900