發(fā)布時間：2017-11-01 02:29

  本文關(guān)鍵詞：蝎毒多肽提取物通過MICA-NKG2D途徑調(diào)控肝臟移植瘤中浸潤自然殺傷細(xì)胞活性的機制

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【摘要】：目的:自然殺傷(Natural killer,NK)細(xì)胞是機體固有免疫系統(tǒng)重要組成部分,在肝臟、肺臟等免疫器官中含量豐富,而且與外周NK細(xì)胞相比其免疫表型、功能等表現(xiàn)出器官特異性。在正常情況下,NK細(xì)胞表面的活化性受體與靶細(xì)胞表面的配體直接結(jié)合并通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì),誘導(dǎo)活化靶細(xì)胞凋亡程序,從而發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用。MICA/NKG2D是NK細(xì)胞活化的主要信號通路,在NK細(xì)胞活化及誘導(dǎo)殺傷靶細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。然而在腫瘤發(fā)生過程中,腫瘤細(xì)胞仍能夠通過多種途徑逃避機體的免疫監(jiān)視功能,研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞抗原異常表達、腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子及其他免疫細(xì)胞相互作用等因素所引起的NK細(xì)胞活性降低對于誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的發(fā)生起了重要作用。因此,提高NK細(xì)胞活性,增強其對腫瘤細(xì)胞的殺傷識別及清除作用被視為抵抗腫瘤免疫逃逸,抑制腫瘤增殖的重要渠道。我們在前期研究發(fā)現(xiàn):蝎毒多肽提取物(polypeptide extract from scorpion venom,PESV)對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,并通過抑制腫瘤微血管生成、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞抗原提呈,參與對腫瘤細(xì)胞的清除,但PESV對天然免疫細(xì)胞尤其是肝臟NK細(xì)胞在抗腫瘤中的調(diào)節(jié)輔助作用尚未有相關(guān)研究,能否改善NK細(xì)胞在腫瘤患者及荷瘤小鼠中的免疫抑制效應(yīng)是我們關(guān)注研究的重點。在此基礎(chǔ)上,觀察PESV對于肝癌的相關(guān)抑制作用以及腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞的活化的調(diào)節(jié)作用機制,為進一步探討PESV調(diào)節(jié)機體天然免疫、抗腫瘤活性提供新策略。方法:1.PESV對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和正常人外周淋巴細(xì)胞PBLs活性的影響:采用MTT法檢測不同濃度PESV對細(xì)胞活性的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測PESV對Hep G2細(xì)胞周期的影響。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測各藥物干預(yù)組對HepG2細(xì)胞表面mMICA表達比例。3.LDH細(xì)胞毒性檢測法檢測NK細(xì)胞對PESV干預(yù)組HepG2細(xì)胞的殺傷作用:無菌分離正常人外周血NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,以不同藥物處理組HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞,按不同效靶比共同培養(yǎng)4h,采用LDH細(xì)胞毒性檢測NK細(xì)胞殺傷功能。4.采用直接注射法構(gòu)建H22肝癌原位移植瘤小鼠模型,術(shù)后隨機分為荷瘤對照組(control),pesv低劑量組(pesv-l,10mg/ml)和pesv高劑量組(pesv-h,40mg/ml),另選取正常非手術(shù)小鼠為正常對照組(normal),分別給予pesv和生理鹽水連續(xù)灌胃14天后處死小鼠取肝腫瘤組織測量腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量,計算抑瘤率。另取同樣建模處理小鼠給予14天用藥干預(yù)后停藥并觀察其荷瘤生存期。5.采用he染色觀察肝臟腫瘤組織病理變化。6.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肝臟、脾臟中cd3-nk1.1+細(xì)胞及其表面nkg2d的表達。7.采用免疫組織化學(xué)法檢測肝臟腫瘤組織中nk1.1+細(xì)胞的浸潤。8.實時定量pcr法檢測肝臟腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶bmrna表達。結(jié)果:1.pesv抑制hepg2細(xì)胞活性mtt結(jié)果顯示:pesv能夠明顯抑制hepg2細(xì)胞的活性,抑制作用呈劑量依賴性,而對pbls細(xì)胞活性沒有明顯影響;細(xì)胞周期結(jié)果顯示pesv能顯著提高g1期hepg2細(xì)胞所占比例,使細(xì)胞增殖停滯在g1期(p0.05)。2.pesv顯著提高h(yuǎn)epg2細(xì)胞表面mmica的表達,增強nk細(xì)胞的殺傷活性流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示不同劑量pesv作用細(xì)胞24h后hepg2細(xì)胞表面mmica的表達顯著提高(p0.05),與不同效靶比的nk細(xì)胞共培養(yǎng)后nk細(xì)胞的殺傷活性顯著提高(p0.05)。采用抗mica抗體封閉后,nk細(xì)胞殺傷活性顯著降低,pesv未見顯著增強作用。3.pesv抑制h22原位移植瘤小鼠腫瘤生長,延長荷瘤生存期pesv大、小劑量組肝臟移植瘤的生長均受到抑制,腫瘤體積和瘤質(zhì)量均低于荷瘤對照組(p0.05),腫瘤抑制率分別為30.77%和15.38%。生存期觀察顯示pesv大劑量組能顯著延長荷瘤小鼠生存時間,生命延長率為34.06%(p0.05);組織病理學(xué)結(jié)果顯示荷瘤對照組肝臟腫瘤細(xì)胞排列緊密,異型性顯著,呈浸潤性生長,pesv大、小劑量組出現(xiàn)明顯壞死區(qū),細(xì)胞異型性減輕。4.pesv提高荷瘤小鼠肝臟及脾臟nk細(xì)胞浸潤,促進其表面活化性受體nkg2d的表達流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與正常對照組相比,荷瘤對照組小鼠肝臟及脾臟nk細(xì)胞所占總淋巴細(xì)胞的頻數(shù)顯著降低,nkg2d表達顯著下調(diào)(p0.05),提示nk細(xì)胞出現(xiàn)免疫抑制;而pesv大劑量組小鼠肝臟nk細(xì)胞占肝臟總淋巴細(xì)胞的比例顯著高于荷瘤對照組(p0.05),同時脾臟nk細(xì)胞比例也顯著提高(p0.05),nk細(xì)胞表面的活化性受體NKG2D表達在PESV組均顯著增高(P0.05),有利于NK細(xì)胞殺傷活性的提高。免疫組化染色結(jié)果顯示,給予PESV處理后NK細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤程度顯著增加(P0.05),且主要分布在癌旁組織中,腫瘤壞死區(qū)域也可見少量分布。5.PESV提高NK細(xì)胞毒性顆粒的表達實時定量PCR結(jié)果顯示,PESV大劑量組腫瘤組織中穿孔素和顆粒酶B的mRNA表達量分別是荷瘤對照組的3.62倍和5.82倍(P0.05),表明PESV能顯著提高腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達。結(jié)論:1.PESV調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖;2.PESV通過提高腫瘤細(xì)胞表面MICA的表達,增強NK細(xì)胞對其殺傷活性;3.PESV抑制小鼠肝臟原位移植瘤的生長,延長生存時間;4.PESV提高肝臟及脾臟NK細(xì)胞浸潤,增強對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用;5.PESV通過MICA-NKG2D途徑調(diào)節(jié)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
【關(guān)鍵詞】：蝎毒 肝腫瘤 自然殺傷細(xì)胞 MICA NKG2D 穿孔素 顆粒酶B
【學(xué)位授予單位】：濟南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 主要符號表13-14
• 前言14-17
• 實驗材料與方法17-28
• 1.1 實驗材料17-19
• 1.2 實驗方法19-28
• 實驗結(jié)果28-38
• 2.1 PESV抑制腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期28-29
• 2.2 PESV上調(diào)mMICA表達提高NK細(xì)胞殺傷活性29-31
• 2.3 PESV的抑瘤作用及對荷瘤小鼠的生存期影響31-32
• 2.4 PESV對原位移植瘤組織病理學(xué)變化的影響32-33
• 2.5 PESV對移植瘤組織及脾臟浸潤NK頻數(shù)的影響33-35
• 2.6 PESV對移植瘤組織及脾臟浸潤NK分布的影響35
• 2.7 PESV對NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的表達變化的影響35-36
• 2.8 PESV對移植瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA表達變化的影響36-38
• 討論38-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-54
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果54-55
• 致謝55

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本文編號：1124878