本文關(guān)鍵詞：Spred-2與Rab11相互作用影響大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞PC12分化

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【摘要】：Spred (Sprouty related with EVH1 domain)蛋白家族是一類(lèi)酪氨酸激酶結(jié)合蛋白。Spred蛋白由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,分別為：N端EVH-1結(jié)構(gòu)域,中央KBD結(jié)構(gòu)域和C端SPR結(jié)構(gòu)域。目前哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的Spred蛋白家族成員主要為Spred-1、Spred-2、Spred-3和Eve-3。 Spred-3缺少KBD結(jié)構(gòu)域,Eve-3僅含有EVH-1結(jié)構(gòu)域。Spred特異性抑制多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的Ras/Raf/Erk信號(hào)通路活化,抑制細(xì)胞分化,但具體機(jī)制復(fù)雜,有待進(jìn)一步闡明。Spred2在不同腺體和分泌組織中均有較高表達(dá),主要定位于細(xì)胞內(nèi)囊泡狀結(jié)構(gòu),與循環(huán)內(nèi)吞體標(biāo)志蛋白R(shí)ab11共定位。Rab11參與細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸,促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)。我們之前的研究及其他研究均表明,Spred-2抑制大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞PC12分化,但機(jī)制不明。我們推測(cè)Rab11可能參與Spred-2調(diào)控的PC12細(xì)胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)Spred-2與Rabll相互作用,并且與自噬標(biāo)志蛋白LC3存在共定位。研究結(jié)果如下：1、免疫熒光檢測(cè)HeLa細(xì)胞內(nèi)源Spred-2與內(nèi)源Rab11定位,結(jié)果表明二者在胞漿中存在聚點(diǎn)狀的共定位；將Myc-Spred-2與HA-Rab11共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞經(jīng)Anti-Myc抗體免疫共沉淀,免疫印跡結(jié)果表明Spred-2與Rab1 1存在相互作用。2、將Myc-Spred-2野生型及其各個(gè)結(jié)構(gòu)域缺失突變體,分別與HA-Rab11共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞,以Anti-Myc抗體免疫共沉淀,免疫印跡結(jié)果表明Spred-2蛋白通過(guò)C端的KBD與SPR結(jié)構(gòu)域與Rabll相互作用。3、將Myc-Spred-2、DsRed-Rab11及綠色熒光蛋白標(biāo)記的LC3(GFP-LC3)共同轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果表明Spred-2、Rab11及LC3三者在胞漿存在共定位。4、分別將Myc標(biāo)簽空載體,Myc-Spred-2野生型及SPR結(jié)構(gòu)域缺失突變體與DsRed-Rab11和GFP-LC3,共轉(zhuǎn)至HeLa細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果表明Spred-2蛋白SPR結(jié)構(gòu)域?yàn)镽ab1 1與LC3共定位所必需。5、共轉(zhuǎn)DsRed-Rabll與GFP-LC3至HeLa細(xì)胞,再分別使用雷帕霉素(Rapa)與氯喹(CQ)處理,免疫熒光結(jié)果表明Rapa促進(jìn)Rab11與LC3共定位,而CQ抑制二者共定位。6、分別將Spred-2野生型及其突變體重組腺病毒感染PC12細(xì)胞,神經(jīng)突觸生長(zhǎng)分析結(jié)果表明SPR結(jié)構(gòu)域及其與LC3結(jié)合位點(diǎn)為Spred-2抑制PC12細(xì)胞分化所必需。綜上所述,Spred-2抑制PC12細(xì)胞分化可能通過(guò)C端區(qū)域與Rab11相互作用,抑制Rab11l參與細(xì)胞分化的功能。Spred-2缺失SPR結(jié)構(gòu)域,Rab11釋放,并促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)。另外,Spred-2參與自噬,在自噬溶酶體形成后與Rab11及LC3形成蛋白復(fù)合體,從而抑制PC12細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：Spred-2 Rab11 PC12
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R736.6
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-12
• 第一章 Spred蛋白家族研究進(jìn)展12-30
• 1. Spred家族的表達(dá)及定位12-14
• 2. Spred蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域及其功能14-16
• 2.1 EVH-1結(jié)構(gòu)域14-15
• 2.2 KBD結(jié)構(gòu)域15
• 2.3 SPR結(jié)構(gòu)域15-16
• 3. Spred生物學(xué)功能16-19
• 3.1 Spred對(duì)于Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路的抑制功能16-17
• 3.2 Spred-2與細(xì)胞分化17-18
• 3.3 Spred-2其他生物學(xué)功能18-19
• 4. Rab11蛋白研究進(jìn)展19-21
• 參考文獻(xiàn)21-30
• 第二章 Spred-2與Rab11相互作用影響大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞PC12分化30-52
• 前言30
• 1 材料與方法30-41
• 1.1 材料30-33
• 1.1.1 細(xì)菌、質(zhì)粒及細(xì)胞30-31
• 1.1.2 主要試劑和配方31
• 1.1.3 溶液配制31-32
• 1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器32-33
• 1.1.5 抗體和抑制劑33
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法33-41
• 1.2.1 目的基因亞克隆及突變體質(zhì)粒構(gòu)建33-36
• 1.2.1.1 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-WT的構(gòu)建33-34
• 1.2.1.2 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-ΔEVH-1的構(gòu)建34-35
• 1.2.1.3 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-ΔKBD的構(gòu)建35
• 1.2.1.4 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-ΔSPR的構(gòu)建35
• 1.2.1.5 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-W370A-L373A-Y386A-L389A的構(gòu)建35
• 1.2.1.6 Spred-2腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定35-36
• 1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存及計(jì)數(shù)36
• 1.2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)36-39
• 1.2.3.1 制備蛋白質(zhì)樣品36-37
• 1.2.3.2 制備免疫共沉淀樣品37
• 1.2.3.3 SDS-PAGE電泳37-38
• 1.2.3.4 上樣38
• 1.2.3.5 電泳38
• 1.2.3.6 電轉(zhuǎn)移38
• 1.2.3.7 抗原抗體反應(yīng)38-39
• 1.2.4 轉(zhuǎn)染39
• 1.2.5 免疫熒光39-40
• 1.2.5.1 細(xì)胞爬片39
• 1.2.5.2 固定39
• 1.2.5.3 透化39
• 1.2.5.4 抗原抗體反應(yīng)39-40
• 1.2.5.5 封片40
• 1.2.6 分析PC12細(xì)胞分化40-41
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-47
• 2.1 內(nèi)源Spred-2與內(nèi)源Rab11共定位41
• 2.2 外源Spred-2與外源Rab11結(jié)合41-42
• 2.3 Spred-2 C端與Rab11結(jié)合42-43
• 2.4 外源Spred-2、Rab11及LC3三者共定位43-44
• 2.5 Spred-2影響Rab11與LC3共定位44-45
• 2.6 自噬誘導(dǎo)劑與抑制劑影響Rab11與LC3共定位45-46
• 2.7 Spred-2與Rab11及LC3相互作用為抑制PC12細(xì)胞分化所必需46-47
• 3 討論47-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 致謝52-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54

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