本文關(guān)鍵詞：LITAF基因在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病機制中的生物學(xué)功能研究

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【摘要】：LITAF (LPS-induced TNF a factor),作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在LPS刺激下可以特異性地識別TNF-a啟動子區(qū)的CTCCC序列,調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。最初發(fā)現(xiàn)LITAF基因在P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的模型中顯著上調(diào)。近年來,不斷有研究表明LITAF可能作為一個抑癌基因在多種人類腫瘤中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn),在成熟型B細(xì)胞淋巴瘤中,LITAF基因的啟動子區(qū)存在高甲基化,而對照樣本中均未檢測到異常甲基化,其在B細(xì)胞淋巴瘤中的生物學(xué)功能仍不清楚。我們知道B細(xì)胞淋巴瘤在生物學(xué)行為和臨床預(yù)后有顯著的異質(zhì)性,尋找新的分子靶點成為當(dāng)前研究的熱點。本研究旨在探索LITAF基因?qū)細(xì)胞淋巴瘤的增殖、凋亡和分化發(fā)育可能存在的調(diào)控作用。 首先,對本實驗室的6株B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株進(jìn)行LITAF表達(dá)水平的檢測,篩選出4株作為過表達(dá)或敲低的模型細(xì)胞。根據(jù)檢測結(jié)果,構(gòu)建LITAF的慢病毒過表達(dá)載體(LITAF-pLVX-IRES-ZsGreen1)感染Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞Ramos和DLBCL細(xì)胞OCI-Ly6。另外,構(gòu)建LITAF的慢病毒敲低載體(LITAF-pLKO.1-puro)感染Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞Namalwa和DLBCL細(xì)胞OCI-Ly3細(xì)胞株。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡實驗,發(fā)現(xiàn)LITAF過表達(dá),可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且過表達(dá)BCL6可逆轉(zhuǎn)由其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另一方面,LITAF被敲低后,經(jīng)饑餓和雙氧水處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,與對照組相比,其凋亡率顯著下降。Western blotting的結(jié)果顯示,LITAF過表達(dá)后激活了線粒體途徑,Bax上調(diào),促進(jìn)了細(xì)胞色素C釋放到線粒體外,剪切PARP,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過細(xì)胞周期和MTT實驗,發(fā)現(xiàn)LITAF可以抑制細(xì)胞增殖,減慢細(xì)胞周期進(jìn)程。同時,抑制NF-κB信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。最后,檢測LITAF對B淋巴細(xì)胞增殖、存活、分化發(fā)育中的重要基因BCL6、Blimp1和C-myc的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),LITAF和BCL6在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)LITAF后能顯著降低BCL6的mRNA水平,而在其敲低后,BCL6的mRNA水平顯著升高。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明,LITAF能結(jié)合到BCL6基因的啟動子區(qū),并抑制其轉(zhuǎn)錄水平。我們通過免疫共沉淀,發(fā)現(xiàn)兩者的蛋白產(chǎn)物相互結(jié)合。并且,免疫熒光顯示,LITAF存在入核現(xiàn)象,其可能與細(xì)胞核內(nèi)的BCL6存在相互作用。此外,Blimp1作為BCL6的下游靶基因,兩者相互抑制,本研究發(fā)現(xiàn),LITAF過表達(dá)后,Blimp1的表達(dá)上調(diào)。而在LITAF敲低后,Blimp1的表達(dá)水平也伴隨著下調(diào)。而C-myc作為Blimp1的經(jīng)典下游基因,同樣受到LITAF的調(diào)節(jié)作用,過表達(dá)LITAF可以抑制C-myc的表達(dá),而在敲低其表達(dá)后,C-myc的表達(dá)顯著上調(diào)。 綜上所述,LITAF可能作為一個抑癌基因調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。文獻(xiàn)報道在B-NHL中LITAF啟動子區(qū)高甲基化,導(dǎo)致基因沉默,其可能與B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中,我們通過過表達(dá)和敲低LITAF的分子技術(shù),研究了B-NHL細(xì)胞的凋亡、增殖和分化相關(guān)基因的表達(dá)水平變化。LITAF基因可能主要通過抑制原癌基因BCL6的表達(dá)和NF-κB信號通路活性,從而抑制細(xì)胞增殖,同時激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外,通過調(diào)節(jié)BCL6下游基因Blimp1和C-myc的表達(dá)水平,從而影響B(tài)淋巴細(xì)胞的分化。當(dāng)然,這其中的分子機制仍有待進(jìn)一步的研究。最后,本研究將繼續(xù)收集臨床樣本,在病例組織學(xué)上通過免疫組織化學(xué)的方法揭示以上研究結(jié)果在B-NHL各個亞型發(fā)病中的作用和實際分子機制。本研究希望能為B細(xì)胞淋巴瘤的臨床診斷和靶向治療提供可能的新的分子靶點。
【關(guān)鍵詞】：B細(xì)胞淋巴瘤 LITAF BCL6 凋亡
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.1
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 目次13-15
• 1 前言15-19
• 2 主要的儀器設(shè)備和試劑19-23
• 2.1 儀器設(shè)備19-20
• 2.2 主要生化試劑20-23
• 3 緩沖液和培養(yǎng)液的配制方法23-30
• 3.1 核酸凝膠電泳緩沖液23
• 3.2 Western Blot緩沖液23-26
• 3.3 分子克隆緩沖液26-28
• 3.4 免疫熒光緩沖液28
• 3.5 細(xì)胞培養(yǎng)液28-30
• 4 實驗方法30-46
• 5 結(jié)果46-63
• 6 討論63-67
• 7 結(jié)論67-68
• 8 參考文獻(xiàn)68-73
• 9 綜述73-87
• 參考文獻(xiàn)80-87
• 10 作者簡歷及在讀期間所取得科研成果87-88

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1121766