本文關(guān)鍵詞：DND1與GRN相互作用的鑒定

  更多相關(guān)文章： 人Dnd1基因 人Grn基因 基因克隆 共定位 免疫共沉淀 GST pull-down

【摘要】：背景:Dnd1基因在小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)生和睪丸生殖細(xì)胞瘤發(fā)生中有重要作用,但其作用機(jī)制及其與人類疾病關(guān)系仍未明了。在前期工作中,我們已通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到四個與人DND1相互作用的蛋白,它們分別是GRN、FLAD1、RNF31、EFEMP1。其中Grn基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、損傷修復(fù)和腫瘤的發(fā)生中起重要作用。由于酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選存在假陽性結(jié)果,為此我們利用免疫共沉淀、GST pull-down及細(xì)胞內(nèi)共定位的方法驗證DND1與GRN的相互作用。我們可通過驗證Grn和Dnd1的相互作用,來找出它們之間的聯(lián)系,為進(jìn)一步闡明Dnd1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。實驗?zāi)康?驗證DND1與GRN的相互作用。實驗方法:(1)用PCR的方法擴(kuò)增Dnd1片段,通過酶切與連接,將Dnd1片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET32a和真核表達(dá)載體pCDNA3.1-myc-his,pemRFP-C1上,再轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞TOP10,菌液PCR鑒定陽性克隆并測序分析;(2)從人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增出Grn片段,通過酶切與連接,將Grn片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-2和真核表達(dá)載體pemGFP-C1上,再轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞TOP10,菌液PCR鑒定陽性克隆并測序分析;(3)通過細(xì)胞內(nèi)共定位的方法,確定GRN與DND1在細(xì)胞內(nèi)相互作用的亞細(xì)胞位置;(4)利用免疫共沉淀技術(shù),驗證DND1與GRN真核表達(dá)產(chǎn)物細(xì)胞內(nèi)是否具有相互作用;(5)利用GST pull-down技術(shù),驗證GRN與DND1原核表達(dá)產(chǎn)物細(xì)胞外是否具有相互作用。實驗結(jié)果:(1)成功構(gòu)建人Dnd1原核表達(dá)和真核表達(dá)的重組載體:pET32a-dnd1,pCDNA3.1-myc-his-dnd1和pemRFP-C1-dnd1;(2)成功構(gòu)建人Grn原核表達(dá)和真核表達(dá)的重組載體:pGEX-4T-2-grn和pemGFP-C1-grn;(3)細(xì)胞內(nèi)共定位實驗結(jié)果表明GRN與DND1在細(xì)胞質(zhì)中有明顯的共定位;(4)免疫共沉淀試驗證實DND1與GRN在真核細(xì)胞內(nèi)具有相互作用;(5)GST pull-down試驗結(jié)果表明DND1與GRN在體外具有相互作用。實驗結(jié)論:利用細(xì)胞內(nèi)共定位實驗、免疫共沉淀和GST pull-down試驗證實GRN與DND1具有相互作用,為繼續(xù)深入研究Dnd1基因信號傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人Dnd1基因 人Grn基因 基因克隆 共定位 免疫共沉淀 GST pull-down
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1.引言10-15
• 1.1 人Dnd110
• 1.2 人Grn10-11
• 1.3 蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)11-15
• 2.實驗材料15-22
• 2.1 試驗儀器15-16
• 2.2 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株16
• 2.3 主要材料16-17
• 2.4 試劑17-22
• 3.實驗方法22-47
• 3.1 Dnd1原核表達(dá)和真核表達(dá)重組載體的構(gòu)建22-30
• 3.2 Grn原核表達(dá)和真核表達(dá)重組載體的構(gòu)建30-36
• 3.3 293T細(xì)胞培養(yǎng)36-37
• 3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染37-39
• 3.5 細(xì)胞共定位39-40
• 3.6 免疫共沉淀40-44
• 3.7 GST pull-down44-47
• 4. 實驗結(jié)果47-62
• 4.1 Dnd1原核表達(dá)和真核表達(dá)重組載體的構(gòu)建47-52
• 4.2 Grn原核表達(dá)和真核表達(dá)重組載體的構(gòu)建52-57
• 4.3 細(xì)胞共定位57-58
• 4.4 免疫共沉淀58-60
• 4.5 GST Pull-down60-62
• 5. 討論62-66
• 6. 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 綜述72-86
• 參考文獻(xiàn)80-86
• 主要縮寫詞表86-88
• 攻讀碩士學(xué)位期間的主要成果88-89
• 致謝89-90

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 諶思;DND1與GRN相互作用的鑒定[D];湖南師范大學(xué);2015年

2 劉博;擬南芥DND1、DND2基因及DND1啟動子的克隆和載體構(gòu)建[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號：1118894