本文關(guān)鍵詞：TGF-β誘導(dǎo)Treg細(xì)胞極化進(jìn)而調(diào)控肝細(xì)胞癌的發(fā)展

  更多相關(guān)文章： 肝細(xì)胞癌 TGF-β Treg細(xì)胞 IL10

【摘要】：研究背景和目的：肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居第三,每年死亡的病例數(shù)超過(guò)50萬(wàn)。因其惡性程度高,預(yù)后差,素有癌中之王的稱號(hào)。隨著肝癌研究的發(fā)展及其治療手段的不斷更新,臨床上肝癌的療效取得了一定提高。但大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已是中晚期,常錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī),手術(shù)切除率僅有20-30%,而常規(guī)放化療敏感性較差,且肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,這些因素使得肝癌患者的預(yù)后仍不盡人意。統(tǒng)計(jì)資料顯示,肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率達(dá)70%,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為進(jìn)一步提高肝癌遠(yuǎn)期療效的最大障礙,也是攻克肝癌的關(guān)鍵問(wèn)題之一。前期對(duì)于肝癌的研究重點(diǎn)主要集中于基因突變方面,比如原癌基因的激活或抑癌基因的失活等,希望找到在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用的節(jié)點(diǎn)分子,同時(shí)也希望像其他腫瘤一樣給臨床上肝癌一個(gè)詳細(xì)的分型。由于肝癌的異質(zhì)性,目前這方面的研究不如人意。近期一些研究發(fā)現(xiàn),免疫微環(huán)境在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用,相關(guān)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞如Treg細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和Th17細(xì)胞等在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的重用,可通過(guò)分泌相關(guān)炎性因子作用于腫瘤細(xì)胞起促進(jìn)或抑制作用。Treg細(xì)胞對(duì)維持免疫微環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用,并參與外周免疫耐受的維持以及防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生,其主要的標(biāo)志物是Foxp3。相關(guān)研究表明,腫瘤組織中浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞對(duì)宿主的免疫應(yīng)答起著抑制作用,因此其在腫瘤的治療中起著負(fù)面效應(yīng)。TGF-β主要是有活化的巨噬細(xì)胞分泌,一些受損傷的肝細(xì)胞也能分泌少量的TGF-p,可通過(guò)作用于TGF-β受體后激活下游的smad2/3,促進(jìn)smad2/3的入核,在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。相關(guān)研究表明TGF-β參與了CD4+自然T細(xì)胞分化成為Treg細(xì)胞的過(guò)程,其在宿主免疫應(yīng)答以及免疫耐受的調(diào)控過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。前期研究表明,TGF-β可以誘導(dǎo)TCR缺陷的CD4+CD25-自然T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá),導(dǎo)致外周CD4+CD25-自然T細(xì)胞向CD4+CD25-Treg細(xì)胞分化,具有強(qiáng)大的免疫抑制潛能。此外,研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β在人類外周血Treg細(xì)胞的傳代和擴(kuò)增過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用。SM-16是特異性的TGF-β一型受體抑制劑,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SM-16可通過(guò)阻斷TGF-β通路抑制肝纖維化的進(jìn)展,然而SM-16在肝癌中的作用并未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題將通過(guò)TGF-β一型受體抑制劑SM-16研究TGF-β在肝癌進(jìn)展中對(duì)Treg細(xì)胞的作用,并結(jié)合臨床相關(guān)樣本分析TGF-p與IL10的相關(guān)性。研究方法：將小鼠隨機(jī)分為三組,即健康小鼠組、DEN小鼠組以及DEN+SM-16阻斷小鼠組。研究健康小鼠組、DEN小鼠組以及DEN+SM-16小鼠組中HCC的發(fā)展過(guò)程、TGF-β以及Foxp3表達(dá)水平、血清中TGF-β的水平、血清中IL-10的水平、血清中GP73的水平和Treg細(xì)胞的比例。在體外通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析TGF-β在Treg細(xì)胞極化過(guò)程中的作用。通過(guò)免疫組化的方式鑒定HCC患者腫瘤樣本中TGF-β以及IL-10的表達(dá)水平,并分析兩者的相關(guān)性。研究結(jié)果：1.在DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠模型中,我們證明了SM-16能否成功阻斷TGF-β。2.我們于不同的時(shí)間段處死三組小鼠,并取得其肝臟組織。PCR結(jié)果顯示DEN小鼠組的TGF-β表達(dá)水平顯著高于另外兩組。而ELISA的結(jié)果顯示DEN小鼠組外周血中TGF-p的蛋白濃度顯著高于另外兩組。在蛋白水平,通過(guò)western blot檢測(cè),我們同樣發(fā)現(xiàn)DEN小鼠組的肝臟組織中TGF-β的蛋白水平也明顯高于其他兩組。3.通過(guò)HE染色觀察三組小鼠肝臟的組織學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)DEN小鼠組的肝臟損傷明顯較另外兩組嚴(yán)重,表現(xiàn)為肝組織致密且出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。DEN+SM-16小鼠組的損傷程度與健康組大體相當(dāng)�？梢�(jiàn),TGF-β阻斷后對(duì)肝臟可起到一定的保護(hù)作用。4.從生物指標(biāo)的角度來(lái)看,GP73是一種常見(jiàn)的肝癌早期血清標(biāo)志物,我們通過(guò)Elisa檢測(cè)其血清含量,發(fā)現(xiàn)DEN+SM-16組的GP73血清含量明顯低于肝癌組,證明了SM-16處理后,肝癌的惡性程度下降了。5.我們通過(guò)流式檢測(cè)了三組小鼠脾臟中CD4T細(xì)胞四種亞型相關(guān)基因Th1、Th2、Th17以及Treg細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在TGF-β阻斷前后發(fā)生了明顯的變化,而其余的細(xì)胞均保持穩(wěn)定。6.在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)了Treg細(xì)胞相關(guān)基因Foxp3的表達(dá)。在血清中,我們又利用ELISA檢測(cè)Treg細(xì)胞效應(yīng)分子IL-10的蛋白濃度。發(fā)現(xiàn)兩者在DEN小鼠組中的表達(dá)明顯高于其他兩組。7.我們對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行了臨床樣品的驗(yàn)證。提取不同分期肝癌組織樣本的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。發(fā)現(xiàn)TGF-β與IL-10的表達(dá)與肝癌的進(jìn)展呈正相關(guān)。此外,我們對(duì)TGF-β以及IL-10的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩者在肝癌患者組織樣本中高度相關(guān)。結(jié)論：本項(xiàng)研究證實(shí)SM-16對(duì)小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型中的TGF-β具有抑制作用,可在核酸及蛋白水平下調(diào)TGF-β的表達(dá),并能抑制小鼠血清中TGF-β的分泌。同時(shí)也證實(shí)了SM-16可以抑制肝癌的進(jìn)展及惡性程度。相關(guān)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SM-16可以降低Treg細(xì)胞的比例。臨床相關(guān)研究證實(shí)肝癌組織中TGF-β與IL10呈相關(guān)性。綜上所述,TGF-β可以通過(guò)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的極化而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞癌 TGF-β Treg細(xì)胞 IL10
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 縮略詞表13-14
• 引言14-15
• 材料和方法15-26
• 一、材料15-18
• (一) 主要化學(xué)和生物試劑15
• (二) 載體、菌株和抗體15-16
• (三) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• (四) 主要緩沖液16-18
• 二、儀器設(shè)備18-19
• 三、實(shí)驗(yàn)方法19-26
• (一) 動(dòng)物模型19
• (二) 免疫印記(Western Blot)19-21
• (三) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)21-22
• (四) 細(xì)胞流式分析(Fluorescence activated cell sorting)22
• (五) 血漿細(xì)胞因子測(cè)定22
• (六) 免疫組織化學(xué)22-23
• (七) HE染色23-24
• (八) 免疫組化圖片軟件評(píng)分24-25
• (九) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25-26
• 結(jié)果26-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 文獻(xiàn)綜述143-51
• 摘要43
• 引言43-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 文獻(xiàn)綜述251-58
• 摘要51
• 引言51-52
• IGF在肝癌發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制52-54
• 展望54-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 文獻(xiàn)綜述358-67
• 摘要58-59
• 引言59-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-67
• 發(fā)表論文和科研工作情況說(shuō)明67-69
• 附件69-78
• 致謝78-82

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