本文關(guān)鍵詞：TGF-β誘導(dǎo)Treg細胞極化進而調(diào)控肝細胞癌的發(fā)展

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【摘要】：研究背景和目的：肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居第三,每年死亡的病例數(shù)超過50萬。因其惡性程度高,預(yù)后差,素有癌中之王的稱號。隨著肝癌研究的發(fā)展及其治療手段的不斷更新,臨床上肝癌的療效取得了一定提高。但大多數(shù)肝癌患者確診時已是中晚期,常錯失手術(shù)時機,手術(shù)切除率僅有20-30%,而常規(guī)放化療敏感性較差,且肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,這些因素使得肝癌患者的預(yù)后仍不盡人意。統(tǒng)計資料顯示,肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率達70%,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為進一步提高肝癌遠期療效的最大障礙,也是攻克肝癌的關(guān)鍵問題之一。前期對于肝癌的研究重點主要集中于基因突變方面,比如原癌基因的激活或抑癌基因的失活等,希望找到在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用的節(jié)點分子,同時也希望像其他腫瘤一樣給臨床上肝癌一個詳細的分型。由于肝癌的異質(zhì)性,目前這方面的研究不如人意。近期一些研究發(fā)現(xiàn),免疫微環(huán)境在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中同樣發(fā)揮著重要作用,相關(guān)腫瘤浸潤免疫細胞如Treg細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和Th17細胞等在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的重用,可通過分泌相關(guān)炎性因子作用于腫瘤細胞起促進或抑制作用。Treg細胞對維持免疫微環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用,并參與外周免疫耐受的維持以及防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生,其主要的標志物是Foxp3。相關(guān)研究表明,腫瘤組織中浸潤的Treg細胞對宿主的免疫應(yīng)答起著抑制作用,因此其在腫瘤的治療中起著負面效應(yīng)。TGF-β主要是有活化的巨噬細胞分泌,一些受損傷的肝細胞也能分泌少量的TGF-p,可通過作用于TGF-β受體后激活下游的smad2/3,促進smad2/3的入核,在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。相關(guān)研究表明TGF-β參與了CD4+自然T細胞分化成為Treg細胞的過程,其在宿主免疫應(yīng)答以及免疫耐受的調(diào)控過程中也發(fā)揮重要作用。前期研究表明,TGF-β可以誘導(dǎo)TCR缺陷的CD4+CD25-自然T細胞中Foxp3的表達,導(dǎo)致外周CD4+CD25-自然T細胞向CD4+CD25-Treg細胞分化,具有強大的免疫抑制潛能。此外,研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β在人類外周血Treg細胞的傳代和擴增過程中同樣發(fā)揮著重要作用。SM-16是特異性的TGF-β一型受體抑制劑,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SM-16可通過阻斷TGF-β通路抑制肝纖維化的進展,然而SM-16在肝癌中的作用并未見報道。因此,本課題將通過TGF-β一型受體抑制劑SM-16研究TGF-β在肝癌進展中對Treg細胞的作用,并結(jié)合臨床相關(guān)樣本分析TGF-p與IL10的相關(guān)性。研究方法：將小鼠隨機分為三組,即健康小鼠組、DEN小鼠組以及DEN+SM-16阻斷小鼠組。研究健康小鼠組、DEN小鼠組以及DEN+SM-16小鼠組中HCC的發(fā)展過程、TGF-β以及Foxp3表達水平、血清中TGF-β的水平、血清中IL-10的水平、血清中GP73的水平和Treg細胞的比例。在體外通過流式細胞檢測實驗分析TGF-β在Treg細胞極化過程中的作用。通過免疫組化的方式鑒定HCC患者腫瘤樣本中TGF-β以及IL-10的表達水平,并分析兩者的相關(guān)性。研究結(jié)果：1.在DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠模型中,我們證明了SM-16能否成功阻斷TGF-β。2.我們于不同的時間段處死三組小鼠,并取得其肝臟組織。PCR結(jié)果顯示DEN小鼠組的TGF-β表達水平顯著高于另外兩組。而ELISA的結(jié)果顯示DEN小鼠組外周血中TGF-p的蛋白濃度顯著高于另外兩組。在蛋白水平,通過western blot檢測,我們同樣發(fā)現(xiàn)DEN小鼠組的肝臟組織中TGF-β的蛋白水平也明顯高于其他兩組。3.通過HE染色觀察三組小鼠肝臟的組織學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)DEN小鼠組的肝臟損傷明顯較另外兩組嚴重,表現(xiàn)為肝組織致密且出現(xiàn)大量中性粒細胞浸潤。DEN+SM-16小鼠組的損傷程度與健康組大體相當�？梢�,TGF-β阻斷后對肝臟可起到一定的保護作用。4.從生物指標的角度來看,GP73是一種常見的肝癌早期血清標志物,我們通過Elisa檢測其血清含量,發(fā)現(xiàn)DEN+SM-16組的GP73血清含量明顯低于肝癌組,證明了SM-16處理后,肝癌的惡性程度下降了。5.我們通過流式檢測了三組小鼠脾臟中CD4T細胞四種亞型相關(guān)基因Th1、Th2、Th17以及Treg細胞的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg細胞在TGF-β阻斷前后發(fā)生了明顯的變化,而其余的細胞均保持穩(wěn)定。6.在轉(zhuǎn)錄水平檢測了Treg細胞相關(guān)基因Foxp3的表達。在血清中,我們又利用ELISA檢測Treg細胞效應(yīng)分子IL-10的蛋白濃度。發(fā)現(xiàn)兩者在DEN小鼠組中的表達明顯高于其他兩組。7.我們對所得的結(jié)果進行了臨床樣品的驗證。提取不同分期肝癌組織樣本的RNA進行轉(zhuǎn)錄分析。發(fā)現(xiàn)TGF-β與IL-10的表達與肝癌的進展呈正相關(guān)。此外,我們對TGF-β以及IL-10的表達進行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩者在肝癌患者組織樣本中高度相關(guān)。結(jié)論：本項研究證實SM-16對小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型中的TGF-β具有抑制作用,可在核酸及蛋白水平下調(diào)TGF-β的表達,并能抑制小鼠血清中TGF-β的分泌。同時也證實了SM-16可以抑制肝癌的進展及惡性程度。相關(guān)檢測發(fā)現(xiàn)SM-16可以降低Treg細胞的比例。臨床相關(guān)研究證實肝癌組織中TGF-β與IL10呈相關(guān)性。綜上所述,TGF-β可以通過誘導(dǎo)Treg細胞的極化而促進肝癌的進展。
【關(guān)鍵詞】：肝細胞癌 TGF-β Treg細胞 IL10
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 縮略詞表13-14
• 引言14-15
• 材料和方法15-26
• 一、材料15-18
• (一) 主要化學(xué)和生物試劑15
• (二) 載體、菌株和抗體15-16
• (三) 實驗動物16
• (四) 主要緩沖液16-18
• 二、儀器設(shè)備18-19
• 三、實驗方法19-26
• (一) 動物模型19
• (二) 免疫印記(Western Blot)19-21
• (三) 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)21-22
• (四) 細胞流式分析(Fluorescence activated cell sorting)22
• (五) 血漿細胞因子測定22
• (六) 免疫組織化學(xué)22-23
• (七) HE染色23-24
• (八) 免疫組化圖片軟件評分24-25
• (九) 統(tǒng)計學(xué)分析25-26
• 結(jié)果26-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-43
• 文獻綜述143-51
• 摘要43
• 引言43-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻48-51
• 文獻綜述251-58
• 摘要51
• 引言51-52
• IGF在肝癌發(fā)生過程中的分子機制52-54
• 展望54-55
• 參考文獻55-58
• 文獻綜述358-67
• 摘要58-59
• 引言59-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-67
• 發(fā)表論文和科研工作情況說明67-69
• 附件69-78
• 致謝78-82

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