本文關(guān)鍵詞：HMGB1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及初步分子機(jī)制探討

  更多相關(guān)文章： 高遷移率族蛋白1 胃癌 增殖 遷移 凋亡 生物學(xué)功能 信號(hào)通路

【摘要】：研究背景1973年,一組在電泳下具有高遷移率的非組蛋白核蛋白被發(fā)現(xiàn)并且被命名為高遷移率族(high-mobility group HMG)蛋白,高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein HMGB1)是其中含量最豐富并且研究最充分的HMG蛋白。HMGB1在多種人類疾病中,尤其是在腫瘤及炎癥性疾病中扮演重要角色。HMGB1在胞內(nèi)不僅是DNA分子伴侶、染色體監(jiān)管者、細(xì)胞自噬維持者、凋亡細(xì)胞的保護(hù)者,并且在細(xì)胞外HMGB1可以發(fā)揮細(xì)胞因子,趨化因子和生長(zhǎng)因子活性,參與炎癥和免疫應(yīng)答反應(yīng)。HMGB1功能缺陷與腫瘤演進(jìn)的每一種標(biāo)志均相關(guān),并且在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮作用。HMGB1的這些特征使其成為腫瘤研究中的重要分子靶點(diǎn)。盡管如此,目前在胃癌中HMGB1的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制仍知之甚少。目的檢測(cè)慢病毒載體干擾HMGB1表達(dá)后,胃癌細(xì)胞系SGC-7901的生物學(xué)活性,利用基因芯片技術(shù)篩選潛在下游作用因子,并進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證。方法針對(duì)4個(gè)HMGB1靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)特異性干擾sh RNA小分子(HMGB1-sh RNA1,HMGB1-sh RNA 2,HMGB1-sh RNA 3,HMGB1-sh RNA 4),分別構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染載體GV115-HMGB1-KD1(KD1)、GV115-HMGB1-KD2(KD2)、GV115-HMGB1-KD3(KD3)、GV115-HMGB1-KD4(KD4),并構(gòu)建陰性對(duì)照載體GV115-HMGB1-NC(NC)。分別通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞。RT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HMGB1的表達(dá)。胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為通過(guò)下述實(shí)驗(yàn)方法分析:MTT實(shí)驗(yàn)和Brd U實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆數(shù),流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移。用敲減組及陰性病毒對(duì)照組通過(guò)基因芯片技術(shù)探索下游基因。選擇下游信號(hào)通路并進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果RT-PCR示KD1、KD2、KD4顯著抑制HMGB1的表達(dá)(75%),KD2組抑制效率最高。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)相對(duì)于陰性病毒對(duì)照組(NC)和空白細(xì)胞對(duì)照組(CON),KD2組HMGB1表達(dá)顯著抑制(P0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)和Brd U實(shí)驗(yàn)證實(shí)了與CON組和NC組相比,KD2組顯著抑制細(xì)胞增殖(P0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)示KD2組較NC組細(xì)胞克隆數(shù)減少(P0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示KD2組相對(duì)CON組和NC組細(xì)胞遷移率受到顯著抑制(P0.05)。相對(duì)NC組,KD2組的細(xì)胞凋亡率顯著增加。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了KD2組的S期細(xì)胞較NC組細(xì)胞數(shù)量減少(P0.05)。基因芯片分析證實(shí)了通過(guò)抑制HMGB1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)778種基因上調(diào),587種基因下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明HMGB1可能在胃癌細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路中的RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9(JNK2)等因子的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用。結(jié)論HMGB1干擾慢病毒載體構(gòu)建成功,通過(guò)該載體我們得到穩(wěn)定的HMGB1低表達(dá)胃癌細(xì)胞,下調(diào)HMGB1可以抑制細(xì)胞增殖,克隆形成和遷移,增加細(xì)胞凋亡。在胃癌中HMGB1可能通過(guò)調(diào)控MAPK通路中的RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9(JNK2)等分子發(fā)揮生物學(xué)作用。
【關(guān)鍵詞】：高遷移率族蛋白1 胃癌 增殖 遷移 凋亡 生物學(xué)功能 信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-24
• 1 胃癌的研究背景14
• 2 HMGB1 研究背景14-21
• 3 HMGB1 與腫瘤研究現(xiàn)狀21-22
• 4 HMGB1 與胃癌的研究現(xiàn)狀22
• 5 本實(shí)驗(yàn)的研究目的及意義22-24
• 實(shí)驗(yàn)一 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞系的建立及鑒定24-37
• 1 材料24-26
• 1.1 細(xì)胞系與質(zhì)粒24
• 1.2 主要試劑和儀器24-26
• 2 方法26-32
• 2.1 HMGB1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建26-28
• 2.2 慢病毒小量包裝及其滴度測(cè)定28-29
• 2.3 胃癌細(xì)胞慢病毒感染29-31
• 2.4 RT-PCR內(nèi)源篩選有效靶點(diǎn)31-32
• 2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)32
• 3 結(jié)果32-35
• 3.1 慢病毒干擾載體GV155HMGB1陽(yáng)性克隆PCR鑒定32-33
• 3.2 慢病毒干擾載體GV155HMGB1的DNA測(cè)序結(jié)果33
• 3.3 慢病毒包裝與病毒滴度測(cè)定33-34
• 3.4 RT-PCR內(nèi)源篩靶結(jié)果34-35
• 3.5 Western blot驗(yàn)證結(jié)果35
• 4 討論35-37
• 實(shí)驗(yàn)二 HMGB1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響37-46
• 1 材料37-38
• 1.1 研究對(duì)象37
• 1.2 主要試劑和儀器37-38
• 2 方法38-40
• 2.1 胃癌細(xì)胞慢病毒感染38
• 2.2 MTT實(shí)驗(yàn)38
• 2.3 Brd U摻入實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)39
• 2.5 凋亡實(shí)驗(yàn)（Annexin V-APC單染法）39
• 2.6 細(xì)胞周期檢測(cè)39-40
• 2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)40
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理40
• 3 結(jié)果40-45
• 3.1 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞的增殖顯著降低40-42
• 3.2 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞的克隆形率顯著降低42
• 3.3 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞的凋亡數(shù)增多42-43
• 3.4 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)明顯減少43-44
• 3.5 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞的遷移率降低44-45
• 4 討論45-46
• 實(shí)驗(yàn)三 HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞Affymetrix芯片檢測(cè)分析46-57
• 1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 1.1 研究對(duì)象46
• 1.2 主要試劑和儀器46-47
• 2 方法47-48
• 2.1 樣本總RNA質(zhì)檢47
• 2.2 3’IVT反應(yīng)47-48
• 2.3 雜交48
• 2.4 洗染及掃描48
• 2.5 標(biāo)準(zhǔn)化方法及軟件48
• 2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下游基因48
• 3 結(jié)果48-55
• 3.1 質(zhì)檢結(jié)果48-49
• 3.2 有顯著差異表現(xiàn)的基因數(shù)目及目的基因表現(xiàn)。49-50
• 3.3 聚類圖50
• 3.4 火山圖50-51
• 3.5 散點(diǎn)圖51-52
• 3.6 Pathway分析52-53
• 3.7 深入分析結(jié)果53
• 3.8 下游基因Western blot驗(yàn)證53-55
• 4 討論55-57
• 小結(jié)57-59
• 參考文獻(xiàn)59-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果69-70
• 致謝70

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