本文關(guān)鍵詞：CCBE1在肺癌中的表達及其與VEGF-C關(guān)系的實驗研究

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【摘要】：研究背景：淋巴管是肺癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑之一,有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肺癌治療預(yù)后的重要因素之一。目前抗淋巴管生成是目前腫瘤治療新的方向,已經(jīng)明確腫瘤相關(guān)淋巴管的形成是腫瘤細胞淋巴轉(zhuǎn)移的必須途徑,但腫瘤新生淋巴管的形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制尚不十分清楚。有研究采用動物模型,通過阻斷血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(VEGFR)-3信號可抑制淋巴管生成,或通過中和趨化因子(如SLC/CCL21)可抑制癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提示腫瘤淋巴管生成和腫瘤細胞淋巴管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并非經(jīng)過單一途徑,還可能與腫瘤血管生成一樣涉及多種調(diào)節(jié)機制,揭示腫瘤細胞轉(zhuǎn)移前淋巴管形成機制有助于提出新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移策略。1)內(nèi)皮祖細胞與淋巴管生成新生成的淋巴管與腫瘤通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后關(guān)系密切。過去普遍認為淋巴管不存在于腫瘤組織內(nèi),但是腫瘤通過淋巴管轉(zhuǎn)移又無從解釋,近期的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織及其腫瘤組織的周圍存在淋巴管,它們成集束狀或分散存在,它們的密度要高于正常的組織,Mandri ota等在動物實驗也證實了淋巴管可以存在于實體瘤內(nèi)。內(nèi)皮細胞的前體細胞是內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs).1997年,Asahara等首先分離出CD34+/VEGFR-3+血管EPCs,這些EPCs來源于人體的外周血中,這些細胞可以分化為血管內(nèi)皮細胞。等到人出生后,血管EPCs主要位于骨髓,只有在病理狀態(tài)下,如血管損傷、組織缺血和腫瘤發(fā)生等,血管EPCs通過細胞因子的誘導(dǎo),從骨髓動員到外周血循環(huán)中,使局部組織的血管再生。2003年,Salyen等從胎肝分離出CD34+/CDl33+ /VEGFR-3+細胞,該群細胞可以分化為淋巴管內(nèi)皮細胞或血管內(nèi)皮細胞。2005年,Wang等從臍帶血分離出表達CD34+/CD133+/VEGFR-3+標志的EPCs,用VEGF-C將其誘導(dǎo)分化為淋巴管內(nèi)皮細胞,故將CD34+/CD133+/VEGFR-3+EPCs命名為淋巴管內(nèi)皮祖細胞(1ymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs),以此與血管EPCs相區(qū)分,研究表明LEPCs參與體內(nèi)淋巴管新生如腎移植后。有數(shù)據(jù)表明外周血中VEGFR-3+LEPCs強陽性的非小細胞肺癌患者預(yù)后較差,可能與其更早發(fā)生淋巴管、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移相關(guān)。2)SDF-1/CXCR4與淋巴管生成近年來,人們越來越關(guān)注趨化因子受體(CXC chemokine receptor-4,CXCR4)及其配體基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)相互作用形成的反應(yīng)軸SDF-1/CXCR4在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用,認為腫瘤組織中新生的血管與其誘導(dǎo)相關(guān),對腫瘤血管生成具有調(diào)節(jié)作用。在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸可能與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。2001年Muller等人發(fā)現(xiàn),趨化因子受體CXCR4和CCR7高表達于乳腺癌細胞系、乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中,其配體SDF-1和CCL21在常見的轉(zhuǎn)移部位如淋巴結(jié)、肺、肝臟和骨髓等也存在高水平表達現(xiàn)象,CXCR高表達是早期乳腺癌遠處復(fù)發(fā)的高危因素。越來越多的研究顯示多種包括非小細胞肺癌在內(nèi)的多種實體腫瘤組織中CXCR4均有著過量的表達,非小細胞肺癌中CXCR4表達的差異與其轉(zhuǎn)移潛能密切相判,最近的研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4激活ERK信號系統(tǒng)進而活化IKK和NF-kB信號轉(zhuǎn)到通路進而增加MMM-9表達,促進肺癌細胞的遷移。目前認為SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸在介導(dǎo)誘發(fā)腫瘤細胞侵襲反應(yīng)中主要與血管新生相關(guān),癌細胞通過大量的克隆增殖,侵入局部組織,在血管內(nèi)皮生長因子的作用下,誘導(dǎo)產(chǎn)生新的血管,并且CXCR4在新生血管表面高表達,然后癌細胞在原發(fā)病灶脫離,穿過新生血管壁進入體循環(huán),CD34陽性細胞在富含SDF-1器官的血管壁中捕獲癌細胞,癌細胞至此由癌組織轉(zhuǎn)移到至正常組織。隨后的研究發(fā)現(xiàn),CXCR表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性,Kato等對79例手術(shù)切除的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織分析得知,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌也存在CXCR4局灶性高表達的現(xiàn)象,Tanabe等在動物實驗中也發(fā)現(xiàn),在有淋巴管浸潤的貓的乳腺癌組織中與CXCR4mRNA表達水平存在正相關(guān),但使用CXCR4拮抗劑T140或通過反義RNA干擾技術(shù)均可抑制乳腺癌細胞在體外的遷移反應(yīng)。由于新生血管和新生淋巴管都有相同的前體祖細胞,既然SDF-1/CXCR能調(diào)控新生血管的形成,那么SDF-1/CXCR軸在肺癌淋巴管新生中到底有怎樣的作用呢?3) VEGF-C/VEGFR-3與肺癌淋巴管轉(zhuǎn)移VEGF-C是目前發(fā)現(xiàn)的最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子,是VEGF家族中的一員,其特異性的受體是VEGFR-3,與淋巴管上皮有很高的化學親和性,可以誘導(dǎo)淋巴上皮增殖和淋巴竇新生,明顯表達于淋巴管豐富的區(qū)域。在非小細胞肺癌患者中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中淋巴液中VEGF-C水平較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著升高,肺癌組織中VEGF-C/VEGFR-3表達的強度與肺癌淋巴管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性。VEGF-C作為紀體與VEGFR-3結(jié)合,可使受體磷酸化,從而發(fā)揮酪氨酸激酶活性,淋巴管內(nèi)皮細胞在MEK/ERK和PI3/AKT途徑的刺激下進行有絲分裂,促進淋巴管生成,起到淋巴管生成因子的作用。如果SDF-1/CXCR活化能刺激肺癌組織淋巴管的新生,其作用是否與促進LEPCs表達VEGF-C相關(guān)?4) CCBE1以及VEGF-C和淋巴管轉(zhuǎn)移有實驗證實,CCBE1對于VEGF-C的激活起著至關(guān)重要的作用。在嚙齒類動物胚胎時期誘導(dǎo)CCBE1突變,驗證得知,動物的主要淋巴管道無法形成,即使是從主靜脈分化形成淋巴管的Prox1+中也無法形成淋巴管道,此實驗說明,VEGF-C/VEGFR-3通路激活淋巴系統(tǒng)在CCBE1突變前才能實現(xiàn)。因此,CCBE1在胚胎時期通過誘導(dǎo)VEGF-C使其激活,進而促進機體的淋巴管生成。然而,有實驗證實,CCBE1對于淋巴管的生成作用不大,其主要是通過激活VEGF-C/VEGFR-3通路,從而對淋巴管的生成起作用。所以,CCBE1對于淋巴管的生成是充分但不必要的條件。目的：1.通過收取的人體肺癌組織及正常組織進行對比,通過檢測兩組中CCBE1的表達以及淋巴管的特異抗體LYVE-1的表達,確認LYVE-1在兩種組織之間的表達情況,進而明確CCBE1與LYVE-1之間的關(guān)系；2.將制作的三組慢病毒分別導(dǎo)入到小鼠肺癌細胞中,經(jīng)過在細胞中穩(wěn)定表達后,通過嘌呤霉素篩選,殺死未導(dǎo)入病毒的小鼠肺癌細胞,緊接著將篩選的細胞培養(yǎng)待用；3.將篩選好的小鼠肺癌細胞進行western blot篩選,篩選出抑制效果最好的-組病毒株,預(yù)備待用；4.將處理好的小鼠肺癌細胞和沒有處理的小鼠肺癌細胞導(dǎo)入C57小鼠內(nèi),待小鼠成瘤后檢測兩組中VEGF-C的表達量,得出兩者之間的關(guān)系。方法：1.采用Q-PCR技術(shù)檢測CCBE1在正常組織和肺癌組織中的表達情況；接著運用免疫組化跟western blot技術(shù)檢測正常組織跟肺癌組織中CCBE1以及LYVE-1的表達水平。2.在無菌條件下培養(yǎng)小鼠肺癌細胞,待到穩(wěn)定培養(yǎng)3代左右進行病毒轉(zhuǎn)染,并在熒光顯微鏡下觀察導(dǎo)入細胞的狀態(tài),進而運用嘌呤霉素篩選；3.將篩選出來的三組含有病毒處理的細胞進行western blot處理,根據(jù)western blot結(jié)果選取抑制效果最明顯的一組,將抑制效果最好的一組跟未經(jīng)處理的小鼠肺癌細胞導(dǎo)入分好組的成年雄鼠體內(nèi),待到成瘤后,處死小鼠,完整切取腫瘤組織行western blot處理,觀察兩組組織中VEGF-C的表達情況。結(jié)果：1. CCBE1在肺癌中的表達及其與LYVE-1的關(guān)系在Q-PCR中,兩組數(shù)據(jù)存在明顯的差異,在正常組織中,CCBE1的表達要高于肺癌組織,尤其是在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中,CCBE1的表達更低,可見,CCBE1在肺癌組織中為低表達；在免疫組化和western blot實驗中,兩種組織中,CCBE1在正常組織中的表達量要高于肺癌組織中,此結(jié)果跟Q-PCR的結(jié)果相吻合,但是對于淋巴管的特異標記抗體—— LYVE-1來說,其表達水平跟CCBE1正好相反,在肺癌組織中表達要高于正常的肺組織,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達更高,此結(jié)果表明,CCBE1跟LYVE-1的表達存在負相關(guān)。2.病毒導(dǎo)入小鼠肺癌細胞將事先準備好的小鼠肺癌細胞放于溫箱內(nèi)培養(yǎng),將病毒連同polybrene按照一定的比例配制完善,導(dǎo)入小鼠肺癌細胞,并在熒光顯微鏡觀察,隨著時間的推移,慢病毒導(dǎo)入細胞數(shù)量增多,在顯微鏡視野中的熒光細胞數(shù)目不斷增多。3.小鼠肺癌細胞的篩選將配制好的嘌呤霉素營養(yǎng)液替代原來小鼠肺癌細胞的培養(yǎng)液,未導(dǎo)入病毒的小鼠肺癌細胞殺死。漂浮于培養(yǎng)液表面,12小時后換用無嘌呤霉素的培養(yǎng)液,待細胞生長到整個生長瓶的80%左右,進行第二次嘌呤霉素篩選。4.篩選抑制效果最好的經(jīng)過處理的小鼠肺癌細胞通過對導(dǎo)入病毒的三組小鼠肺癌細胞進行western blot試驗,結(jié)果顯示,ShRNA2的抑制效果最好,另兩組的也有一定的抑制作用,但抑制效果不如ShRNA2,按照實驗結(jié)果,ShRNA2被認為是抑制效果最好的一組。5.將抑制效果最好的一組導(dǎo)入小鼠體內(nèi)及結(jié)果分析待細胞成瘤以后,完整切除腫瘤組織,通過western blot試驗檢測兩組中VEGF-C的表達情況,抑制組的表達量要高于未經(jīng)處理的小鼠肺癌細胞。結(jié)論：1.正常的肺組織中CCBE1的表達要高于肺癌組織,尤其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中表達更低；LYVE-1的表達正好相反,在肺癌中的表達要高于正常肺組織,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達更高。2.經(jīng)過病毒處理,小鼠肺癌細胞內(nèi)的CCBE1表達量較未經(jīng)處理的細胞表達更低。3. CCBE1表達的是一種保護性的蛋白,能夠抑制VEGF-C的蛋白分泌,從而能夠抑制淋巴管的生成。
【關(guān)鍵詞】：CCBE1LYVE-1 VEGF-C 小鼠肺癌細胞 病毒 嘌呤霉素
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一部分 CCBE1在肺癌中的表達及其與LYVE-1的關(guān)系17-33
• 1 實驗材料17-18
• 2、實驗方法18-26
• 3、實驗結(jié)果26-32
• 4 討論32-33
• 第二部分 小鼠肺癌細胞中CCBE1與VEGF-C的關(guān)系33-55
• 1 實驗材料33-34
• 2、實驗方法34-50
• 3 結(jié)果50-52
• 4 討論52-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻56-69
• 腫瘤的淋巴管生成和淋巴血管重塑（文獻綜述）69-76
• 縮略詞表76-77
• 作者簡介77
• 研究生期間參與發(fā)表的論文77-78
• 致謝78-80

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本文編號：1115033