發(fā)布時(shí)間：2017-10-29 21:10

  本文關(guān)鍵詞：HBx基因轉(zhuǎn)染SUDHL-4細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)侵襲的影響

  更多相關(guān)文章： SUDHL-4 HBx 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 增殖 侵襲 轉(zhuǎn)移

【摘要】：背景和目的:惡性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是淋巴造血系統(tǒng)的腫瘤,按照病理類型分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin disease,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)。在中國,每年新發(fā)惡性腫瘤中淋巴瘤約占4%,是九種常見腫瘤中的一種,其在腫瘤導(dǎo)致的死亡排名中居列第十位,其中又以非霍奇金淋巴瘤為主,占ML的85%~90%。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)在組織學(xué)形態(tài)、遺傳學(xué)特征、免疫表型及臨床表現(xiàn)上都存在著高度的異質(zhì)性,是NHL中最為常見的一類組織學(xué)亞型。臨床上發(fā)現(xiàn)許多惡性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染,兩者的關(guān)系日益受到相關(guān)研究人員的關(guān)注。大量臨床的研究數(shù)據(jù)也進(jìn)一步表明NHL患者乙型肝炎病毒(HBV)感染率明顯高于普通人群及其他相關(guān)性實(shí)體腫瘤的患者,惡性淋巴瘤合并HBV的感染率僅次于肝癌;同時(shí)HBV的再激活在NHL合并HBV感染患者的治療中表現(xiàn)顯著,這些研究和發(fā)現(xiàn)充分表明HBV病毒感染與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展存在著一定的相關(guān)性。乙型肝炎病毒(HBV)具有S、C、P以及X區(qū)4個(gè)重疊開放讀碼框架(ORF),HBV的X基因作為其中最小的ORF,能夠編碼145個(gè)氨基酸組成的蛋白,即HBx。HBx可通過多種不同的作用誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌(HCC)的形成,并促其發(fā)展,其中抑制肝細(xì)胞發(fā)生凋亡在HBV導(dǎo)致HCC發(fā)生的過程中起到巨大的作用。然而,目前的研究和相關(guān)報(bào)道尚不能解釋HBV感染在NHL的發(fā)生和進(jìn)展中的作用及具體機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)選用人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞株SUDHL-4作為研究對(duì)象,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,將HBx基因轉(zhuǎn)入SUDHL-4細(xì)胞株中,建立帶有乙肝病毒的淋巴瘤細(xì)胞模型,研究HBx對(duì)B-NHL細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移的影響并探討其可能的作用機(jī)制,為篩選有效的治療藥物開辟新的途徑,為淋巴瘤合并HBV感染的治療提供更多有力的理論依據(jù)。方法:1、利用分子克隆的方法構(gòu)建HBx基因的真核載體pcDNA3.1-X。2、將pcDNA3.1-X通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入B-NHL細(xì)胞SUDHL-4中,構(gòu)建整合有HBV X基因的淋巴瘤細(xì)胞株SUDHL-4-HBx,以SUDHL-4及轉(zhuǎn)染空載體的B-NHL細(xì)胞SUDHL-4-con作對(duì)照,利用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染96h內(nèi)各組細(xì)胞的增殖情況,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。3、將pcDNA3.1-X通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入SUDHL-4后,用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的SUDHL-4細(xì)胞株,取對(duì)數(shù)期SUDHL-4、SUDHL-4-con和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SUDHL-4-HBx細(xì)胞,利用CCK8法檢測(cè)三種細(xì)胞96h的生長(zhǎng)情況;以SUDHL-4及轉(zhuǎn)染空載體的B-NHL細(xì)胞SUDHL-4-con作對(duì)照,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況,用改良噻唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞粘附力;用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果:1、重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果及質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建pcDNA3.1-X。2、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后SUDHL-4細(xì)胞有HBx mRNA的表達(dá),與SUDHL-4組細(xì)胞及SUDHL-4-con組細(xì)胞相比,SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖減緩,G0/G1期細(xì)胞比例增加、S期細(xì)胞所占比例減少,細(xì)胞凋亡率增加。3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的SUDHL-4細(xì)胞有HBx mRNA及HBx蛋白的表達(dá),與SUDHL-4和SUDHL-4-con組細(xì)胞相比,SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖能力、粘附力及轉(zhuǎn)移侵襲能力有不同程度增強(qiáng);細(xì)胞周期無顯著變化,細(xì)胞凋亡率顯著降低。結(jié)論:1、成功構(gòu)建整合有HBV X基因和蛋白的B-NHL細(xì)胞株SUDHL-4-HBx。2、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因后,SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖減緩,細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,細(xì)胞凋亡率增加。3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因后,SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖能力及粘附力、侵襲轉(zhuǎn)移能力均顯著增強(qiáng);細(xì)胞凋亡率顯著降低。
【關(guān)鍵詞】：SUDHL-4 HBx 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 增殖 侵襲 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 縮略詞表13-15
• 引言15-16
• 第一部分 HBx基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定16-30
• 一 材料與儀器16-17
• 1 血清樣本16
• 2 試劑與主要耗材16-17
• 3 主要儀器17
• 二 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 1 HBV x基因的提取鑒定17-19
• 1.1 乙肝病毒患者血清DNA的提取17-18
• 1.2 HBx基因的PCR擴(kuò)增18-19
• 1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定19
• 2 HBx基因測(cè)序載體構(gòu)建與鑒定19-22
• 2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收19-20
• 2.2 紫外分光光度法測(cè)DNA濃度20
• 2.3 HBV X基因的克隆20-21
• 2.4 測(cè)序質(zhì)粒的提取21
• 2.5 HBV X基因測(cè)序載體的鑒定21-22
• 3 HBx基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定22-25
• 3.1 HBV X基因的酶切及膠回收22-23
• 3.2 T4連接酶連接反應(yīng)23
• 3.3 轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)23-24
• 3.4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-X的濃度和純度測(cè)定24
• 3.5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-X的鑒定24-25
• 三 結(jié)果25-29
• 1 HBV X基因的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果25
• 2 HBV x基因真核載體鑒定結(jié)果25-29
• 四 討論29-30
• 第二部分 HBx 轉(zhuǎn)染 SUDHL-4 對(duì)其生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移的影響30-59
• 一 材料與儀器30-32
• 1 細(xì)胞株30
• 2 試劑與主要耗材30-31
• 3 主要儀器31-32
• 二 所需溶液的配制32-35
• 1 SUDHL-4 細(xì)胞培養(yǎng)所需溶液的配制32-33
• 1.1 含 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液32
• 1.2 臺(tái)盼藍(lán)染液32-33
• 1.3 PBS緩沖溶液33
• 1.4 細(xì)胞凍存液33
• 2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞粘附、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)所需溶液的配制33-34
• 2.1 MTT溶液33
• 2.2 FN溶液33
• 2.3 BSA溶液33
• 2.4 結(jié)晶紫溶液33-34
• 3 Western Bolt實(shí)驗(yàn)所需溶液的配制34-35
• 3.1 電泳緩沖液34
• 3.2 電轉(zhuǎn)緩沖液34
• 3.3 5×SDS loading buffer上樣緩沖液34
• 3.4 TBST緩沖液34
• 3.5 封閉液34
• 3.6 麗春紅染色液34-35
• 三 實(shí)驗(yàn)方法35-46
• 1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存35-36
• 1.1 細(xì)胞復(fù)蘇35
• 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)35
• 1.3 細(xì)胞傳代35
• 1.4 細(xì)胞凍存35-36
• 1.5 單細(xì)胞懸液制備和細(xì)胞計(jì)數(shù)36
• 2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染36-37
• 2.1 G418篩選劑量確定36
• 2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染36-37
• 2.3 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因SUDHL-4 細(xì)胞株的篩選37
• 3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞凋亡的影響37-41
• 3.1 SUDHL-4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染情況37
• 3.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SUDHL-4 細(xì)胞中HBx基因的表達(dá)37-39
• 3.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞增殖的影響39-40
• 3.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞周期和凋亡率的影響40-41
• 4 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞生物學(xué)特性的影響41-46
• 4.1 RT-PCR驗(yàn)證SUDHL4HBx細(xì)胞株中HBx mRNA的表達(dá)41
• 4.2 Western Bolt驗(yàn)證SUDHL4HBx細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)41-44
• 4.3 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞增殖的影響44
• 4.4 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞周期和凋亡的影響44
• 4.5 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞粘附力、遷移力及侵襲力的影響44-46
• 4.6 數(shù)據(jù)分析46
• 四 結(jié)果46-56
• 1 SUDHL-4 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HBx 后形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染情況46-47
• 2 RT-PCR測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因mRNA的表達(dá)47-48
• 3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞增殖的影響48-49
• 4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)?xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響49-50
• 5 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因SUDHL-4 細(xì)胞株的鑒定50-51
• 6 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞增殖的影響51-52
• 7 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞周期和凋亡的影響52-53
• 8 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞粘附力的影響53-54
• 9 穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4 細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響54-56
• 五 討論56-58
• 六 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 綜述62-78
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 個(gè)人簡(jiǎn)介78-79
• 致謝79

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8 周新宇;miR143、miR145對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響作用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李姝;淫羊藿苷對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)CaSR及Survivin、Runx3基因表達(dá)的影響[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2016年

10 金瑛;體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向韌帶細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2016年

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本文編號(hào)：1114664