本文關(guān)鍵詞：阿霉素耐藥Raji細(xì)胞株的建立與Prohibitin及微小RNA-27a的表達(dá)情況分析

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【摘要】：研究背景：非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)是起源于淋巴結(jié)和淋巴組織的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān)。NHL可分為B細(xì)胞性和T細(xì)胞性,其中B細(xì)胞性占大多部分,包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、Bukitt淋巴瘤(BL)等。目前,聯(lián)合化療CHOP(環(huán)磷酰胺+阿霉素+長(zhǎng)春新堿+強(qiáng)的松)方案仍是治療大多數(shù)NHL患者的主要措施。然而,隨著化療藥物的廣泛應(yīng)用,NHL多藥耐藥(MDR)性問題已成為治療失敗的一個(gè)重要原因。已知腫瘤MDR機(jī)制復(fù)雜,涉及多種耐藥相關(guān)基因及其耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的改變以及多種信號(hào)通路的激活,其產(chǎn)生的機(jī)制可能有：藥物外排增加、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)障礙、藥物作用靶標(biāo)改變、DNA損傷修復(fù)功能增強(qiáng)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)改變等。因此,研究針對(duì)MDR相關(guān)基因、蛋白與信號(hào)通路的靶向藥物和開發(fā)有效的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。阿霉素(ADR)是一種經(jīng)典的蒽環(huán)類抗生素,能嵌入DNA堿基對(duì)之間,并緊密結(jié)合到DNA上,阻止RNA轉(zhuǎn)錄過程,抑制RNA合成,也能阻止DNA復(fù)制,屬于細(xì)胞周期非特異性藥物。ADR抗瘤譜廣,療效高,是NHL聯(lián)合化療CHOP方案的重要藥物。然而,ADR相關(guān)的心臟毒性反應(yīng)和化學(xué)耐藥性嚴(yán)重限制了其在NHL中的治療效果,成為NHL治療失敗的一個(gè)重要原因。Burkitt淋巴瘤是一種高度侵襲性的NHL,目前臨床治療效果仍不理想,其體外建立的Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系——Raji,一直以來被廣泛應(yīng)用于人B細(xì)胞淋巴瘤的研究中。通過建立一株體外ADR誘導(dǎo)的Raji耐藥細(xì)胞株,進(jìn)而尋找Raji耐藥株與敏感株之間的差異表達(dá)基因與蛋白,從而發(fā)現(xiàn)與NHL耐藥相關(guān)的新的靶標(biāo)基因,將為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)NHL耐藥機(jī)制并探索有效的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑,最終戰(zhàn)勝NHL臨床耐藥性難題提供有力支持。Prohibitin (PHB)是一類進(jìn)化上高度保守,廣泛存在于各種生物細(xì)胞中的蛋白,PHB基因家族可定位于線粒體、細(xì)胞核及細(xì)胞膜,其在細(xì)胞內(nèi)的不同定位決定了它具有多樣的生物學(xué)功能。人類PHB1和PHB2聚合形成高分子量環(huán)狀復(fù)合體,主要定位于線粒體內(nèi)膜,在維持線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體及其形態(tài)和功能穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。目前在急性淋巴細(xì)胞白血病、卵巢癌、前列腺癌等多種人類惡性腫瘤中證實(shí)PHB通過調(diào)控線粒體膜功能在細(xì)胞抗凋亡中起保護(hù)性作用,從而在耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。我們的前期研究亦發(fā)現(xiàn),ADR處理Raji細(xì)胞后線粒體PHB表達(dá)上調(diào),應(yīng)用P13K/AKT通路抑制劑可以下調(diào)PHB的表達(dá),并增加Raji細(xì)胞對(duì)ADR的化療敏感性。由此我們推測(cè)PHB可能是與NHL多藥耐藥性的發(fā)生密切相關(guān)的一個(gè)靶標(biāo)基因。微小RNA (miRNA)是廣泛存在于真核生物中由20-23個(gè)核苷酸組成的的單鏈小分子RNA,通過抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA兩種方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá),參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能的調(diào)控,從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展,成為潛在的治療靶標(biāo)及新的分子生物學(xué)標(biāo)志物。miRNA在腫瘤細(xì)胞MDR中的作用已日益引起了國(guó)內(nèi)外關(guān)注,而大量研究也已證實(shí),多種miRNAs在NHL細(xì)胞中存在表達(dá)水平的改變,通過調(diào)節(jié)不同靶標(biāo)基因蛋白的表達(dá),調(diào)控淋巴細(xì)胞的分化、發(fā)育與凋亡,進(jìn)而影響NHL的診療和預(yù)后。以miRNA作為切入點(diǎn)設(shè)計(jì)基因藥物將為NHL的靶向基因治療,改善NHL細(xì)胞耐藥性開辟一條新的途徑。研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-27a (miR-27a)在多種腫瘤中高表達(dá),并發(fā)揮原癌基因的作用。此外,miR-27a高表達(dá)還與急性白血病、卵巢癌、胃癌、食管癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生密切相關(guān),其表達(dá)水平的改變可通過改變多藥耐藥基因的表達(dá)水平在白血病、胃癌及食管癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的藥物抵抗中發(fā)揮重要作用。因此,我們推測(cè)miR-27a可能是參與NHL多藥耐藥機(jī)制的另一個(gè)重要靶標(biāo)基因。目前國(guó)內(nèi)外還未見PHB與miR-27a與NHL多藥耐藥性相關(guān)的報(bào)道。本研究中,我們通過建立ADR耐藥的Raji細(xì)胞株,并檢測(cè)ADR耐藥細(xì)胞株及其敏感株中PHB及miR-27a的表達(dá)水平差異,從線粒體蛋白及miRNA的角度闡述與ADR作用密切相關(guān)的新的NHL耐藥分子靶標(biāo),為逆轉(zhuǎn)NHL細(xì)胞多藥耐藥提供新的治療靶點(diǎn)。研究目的：建立阿霉素(ADR)耐藥Raji細(xì)胞株,并檢測(cè)Prohibitin(PHB)及微小RNA-27a (miR-27a)在耐藥細(xì)胞株(Raji/A)及敏感細(xì)胞株(Raji/S)中的表達(dá)差異并探討其臨床意義。研究方法：建立Raji/A細(xì)胞株,相差顯微鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)及生長(zhǎng)特性并計(jì)數(shù),CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,RT-PCR檢測(cè)Raji/A及Raji/S細(xì)胞中miR-27a與PHB基因mRNA的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)PHB1蛋白在Raji/A及Raji/S細(xì)胞線粒體中的表達(dá)。研究結(jié)果：建立了Raji/A細(xì)胞株,其一般形態(tài)及生長(zhǎng)特性與Raji/S細(xì)胞株相比出現(xiàn)差異,增殖速度減慢,耐藥倍數(shù)為306.47倍,對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)、高三尖杉酯堿(HHT)存在交叉耐藥,耐藥倍數(shù)分別為3.44倍和2.88倍,對(duì)甲氨蝶呤(MTX)無交叉耐藥性,脫藥培養(yǎng)1個(gè)月仍保持耐藥性,經(jīng)ADR處理后凋亡明顯減少。miR-27a在Raji/A細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于Raji/S細(xì)胞,為(128.40±31.59)倍(P0.05); PHB1基因mRNA在Raji/A細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于Raji/S細(xì)胞,為(7.66±3.27)倍(P0.05)；PHB2基因mRNA在Raji/A細(xì)胞中的表達(dá)是Raji/S的(1.25±0.47)倍,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); PHB1蛋白在Raji/A細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于Raji/S細(xì)胞。研究結(jié)論：成功構(gòu)建穩(wěn)定Raji/A細(xì)胞模型,PHB1及miR-27a在Raji/A細(xì)胞中高表達(dá)可能參與Raji細(xì)胞ADR耐藥機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：Raji 阿霉素 耐藥 Prohibitin 微小RNA-27a
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.1
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說明13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-26
• 結(jié)果26-28
• 討論28-30
• 結(jié)論30-31
• 附表31-33
• 附圖33-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 綜述37-65
• 參考文獻(xiàn)52-65
• 致謝65-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文66-67
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 唐娟;曹蘭琴;易紅;湯參娥;;Prohibitin蛋白與卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)性的初步研究[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年12期

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本文編號(hào)：1107091