本文關(guān)鍵詞：TPD52L2基因在前列腺癌中的表達(dá)和細(xì)胞功能學(xué)研究

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【摘要】：一、研究背景及目的前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中、老年男性常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。隨著以前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)篩查代表的前列腺早期篩查技術(shù)在全球的推廣,近二十年來,前列腺癌的發(fā)病率不斷上升,最近的研究顯示,在全球男性癌癥中,前列腺癌的發(fā)病率和病死率已分別居第二位和第六位。在美國,前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤之首,病死率僅次于肺癌,是40歲以上男性癌癥第二位死因。近年來,隨著中國社會老齡化程度的加劇、國民健康體檢意識的增強(qiáng)以及腫瘤檢測技術(shù)的提高,伴隨人們居住環(huán)境和生活習(xí)慣的改變,前列腺癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢。因此,近年來針對前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制和臨床上如何早期診斷、治療、判斷預(yù)后的研究已經(jīng)成為全球泌尿外科的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。目前,以前列腺癌根治術(shù)為代表的手術(shù)切除方式是治療局限性前列腺癌最有效的方法之一,然而對于診斷為進(jìn)展期前列腺癌:高血清PSA值,高Gleason評分、且發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,和局限性前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,首選治療方案是內(nèi)分泌治療。內(nèi)分泌治療又稱雄激素剝奪治療對雄激素依賴型前列腺癌療效確切,但雄激素剝奪治療中位有效時(shí)間僅為14-28月,幾乎所有患者最終都將發(fā)展為雄激素非依賴前列腺癌(AIPC)而對雄激素剝奪治療不敏感,對于這類病人,目前缺乏能有效控制病情的治療方案。TPD52L2分子又稱TPD54/D54,是腫瘤蛋白家族D52(tumor protein D52,TPD52)的成員之一。TPD52家族是在研究乳腺癌中差異表達(dá)的基因時(shí)第一次被發(fā)現(xiàn)。該家族蛋白的特征結(jié)構(gòu)是N端具有相類似的雙股卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coil-coiled motif)。TPD52家族最重要的生理功能是參與Ca2+依賴的膜泡運(yùn)輸過程的調(diào)節(jié)。同時(shí)研究顯示,該家族成員蛋白在非精原細(xì)胞癌、精原細(xì)胞癌、導(dǎo)管和小葉型乳腺癌、肝細(xì)胞癌、口腔鱗癌等多種腫瘤組織中過量表達(dá),提示TPD52家族可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。TPD52L2作為家族的新成員,定位于20q13.2-q13.3。近年來,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究提示:敲減TPD52L2分子可以抑制細(xì)胞生長和克隆形成并將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。在口腔鱗癌細(xì)胞中,敲減TPD52L2同樣能抑制細(xì)胞生長并促進(jìn)凋亡,然而在前列腺癌組織和細(xì)胞中,關(guān)于TPD52L2的研究尚無人報(bào)道。研究目的:探討TPD52L2在前列腺癌組織中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系,及與已知臨床預(yù)后因素的相關(guān)性;建立TPD52L2表達(dá)沉默的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞模型,研究TPD52L2對激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞功能和生物學(xué)行為的影響,并探索其可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。二、研究方法、結(jié)果(一)前列腺癌臨床標(biāo)本TPD52L2表達(dá)水平檢測和患者預(yù)后分析我們收集了長征醫(yī)院泌尿外科2010-2012年117例接受前列腺癌根治術(shù)患者的臨床信息和組織標(biāo)本及術(shù)后隨訪信息。前列腺癌患者臨床信息包括患者診斷時(shí)年齡、術(shù)前PSA、術(shù)后病理分期、Gleason評分、病理T分期、包膜侵犯、切緣陽性、周圍神經(jīng)侵犯和精囊侵犯等。所有腫瘤相關(guān)組織標(biāo)本分為癌和癌旁兩部分,每部分各分兩份分別放液氮和福爾馬林浸泡保存。術(shù)后隨訪信息包括生化復(fù)發(fā)時(shí)間。我們采用免疫組化、q PCR方法對所有組織標(biāo)本進(jìn)行TPD52L2表達(dá)水平檢測,并與患者臨床和預(yù)后信息做相關(guān)性分析,結(jié)果提示:相對于前列腺癌旁組織,前列腺癌組織中TPD52L2表達(dá)水平明顯升高,并與術(shù)后Gleason評分呈正相關(guān);生存分析提示:相對于TPD52L2高表達(dá)患者,低表達(dá)患者無生化復(fù)發(fā)時(shí)間具有明顯優(yōu)勢。多因素分析提示:TPD52L2表達(dá)量、Gleason評分和病理T分期是前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。(二)構(gòu)建激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株TPD52L2敲減模型作為前期準(zhǔn)備工作,我們檢測了各種前列腺癌細(xì)胞系中TPD52L2的表達(dá)水平,確定相對高表達(dá)TPD52L2并且惡性程度較高的DU145和PC-3兩株細(xì)胞系作為我們的實(shí)驗(yàn)對象,并用已經(jīng)構(gòu)建好的靶向沉默TPD52L2基因的sh RNA慢病毒對這兩株前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行感染,觀察并記錄慢病毒自身熒光報(bào)告基因(GFP)表達(dá)情況,然后分別利用q PCR技術(shù)和蛋白印記(western blot)對TPD52L2基因的敲減效率進(jìn)行m RNA和蛋白水平的檢測,結(jié)果提示sh RNA慢病毒載體明顯下調(diào)了DU145和PC-3細(xì)胞中TPD52L2的表達(dá)。(三)沉默TPD52L2基因?qū)に胤且蕾囆郧傲邢侔┘?xì)胞株P(guān)C-3和DU145的增殖和克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力的影響本實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié),我們應(yīng)用已構(gòu)建的TPD52L2穩(wěn)定下調(diào)的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株模型,研究TPD52L2對激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞功能和生物學(xué)行為的影響。在已確定通過Lv-sh RNA成功下調(diào)TPD52L2表達(dá)水平的PC-3和DU145前列腺癌細(xì)胞株中,進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。和對照組Lv-sh CON轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,Lv-sh TPD52L2轉(zhuǎn)染的兩株細(xì)胞系的生長明顯受到抑制、克隆形成能力下降、細(xì)胞遷移能力下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且在DU145細(xì)胞系中,Lv-sh TPD52L2轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象。三、結(jié)論通過以上實(shí)驗(yàn),我們得出結(jié)論如下:TPD52L2在前列腺癌組織中過量表達(dá),與Gleason評分呈正相關(guān),并且是前列腺癌根治術(shù)患者術(shù)后生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示,沉默TPD52L2的表達(dá)可抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的相關(guān)腫瘤生物學(xué)功能及特性,說明TPD52L2在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展及激素非依賴表型轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮重要作用,并有望成為前列腺癌的預(yù)后指標(biāo)和治療雄激素抵抗型前列腺癌的一種新的靶向分子。
【關(guān)鍵詞】：TPD52L2 前列腺癌 臨床預(yù)后分析 PC-3細(xì)胞 DU145細(xì)胞 腫瘤生物學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-14
• 前言14-16
• 第一部分：前列腺癌臨床標(biāo)本TPD52L2表達(dá)水平檢測和患者預(yù)后分析16-29
• 一、臨床信息收集16-17
• 二、標(biāo)本檢測17-26
• （一） 實(shí)驗(yàn)對象17
• （二） 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• （三） 實(shí)驗(yàn)方法18-21
• （四） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 三、術(shù)后隨訪及生存分析26-29
• 第二部分：構(gòu)建激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株TPD52L2敲減模型29-37
• 一、實(shí)驗(yàn)材料29-30
• （一） 材料：29
• （二） 試劑：29-30
• （三） 材料和儀器：30
• 二、實(shí)驗(yàn)方法30-35
• （一） TPD52L2-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定30-33
• （二） TPD52L2-shRNA慢病毒感染PC-3、DU145細(xì)胞33-34
• （三） real-time PCR和Western Blot檢測TPD52L2的敲減效率34-35
• （四） 統(tǒng)計(jì)方法35
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-37
• 第三部分：沉默TPD52L2表達(dá)對激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145和PC-3 的增殖活性、克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力的影響37-49
• 一、實(shí)驗(yàn)材料37-38
• （一） 材料37
• （二） 試劑37-38
• （三） 儀器38
• 二、實(shí)驗(yàn)方法38-45
• （一） 激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC-3 和DU145培養(yǎng)傳代38-39
• （二） PC-3、DU145細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞感染39-40
• （三） MTT法測定shRNA TPD52L2慢病毒感染的DU145和PC-3 細(xì)胞增殖活力40-41
• （四） DU145和PC-3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)41-42
• （五） PI染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測DU145和PC-3 細(xì)胞周期42-43
• （六） transwell法測定DU145和PC-3 細(xì)胞的遷移能力43-44
• （七） 統(tǒng)計(jì)方法44-45
• 三、結(jié)果45-49
• 討論49-52
• 結(jié)論52-53
• References53-57
• 綜述57-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 碩士期間發(fā)表論文和參加科研工作情況66-67
• 附件67-72
• 致謝72-73

【共引文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張曉清;PC-1協(xié)同CHIP調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中AR蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

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本文編號：1104934