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甘露糖化殼聚糖納米粒與腫瘤組織結(jié)合能力的研究

發(fā)布時(shí)間：2017-10-27 14:04

本文關(guān)鍵詞：甘露糖化殼聚糖納米粒與腫瘤組織結(jié)合能力的研究

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【摘要】：目的：采用免疫組化染色的方法觀察肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌病理標(biāo)本中腫瘤及正常組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞相關(guān)受體表達(dá)情況,進(jìn)而了解以上細(xì)胞的數(shù)量；尋找一種相對(duì)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的甘露糖化殼聚糖粒制備流程和方法；利用TAMS、Ml巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)豐富的甘露糖受體,以及甘露糖化殼聚糖納米粒能與甘露糖受體特異性結(jié)合的原理,在肝、乳腺、胃、大腸的組織切片中觀察和評(píng)價(jià)甘露糖化殼聚糖粒與腫瘤組織的結(jié)合能力,從而探求一種腫瘤的靶向治療新靶點(diǎn)與新方法。方法：收集結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌及肝癌各50例患者的組織切片,每例患者組織切片均包含有腫瘤及正常組織,腫瘤組織組為觀察組,正常組織組為對(duì)照組,通過(guò)運(yùn)用免疫組化的方法對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物CD68、CD 163進(jìn)行染色,在光鏡鏡視野下對(duì)表達(dá)為黃褐-深褐色的陽(yáng)性染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)TAMs、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞在各類腫瘤組織、正常組織中所占的比例；采用離子交聯(lián)法構(gòu)建出不同粒徑大小甘露糖化殼聚糖納米粒,取19mg殼聚糖并配置成為濃度4mg/ml的溶液,在其中加入1%的冰醋酸,在室溫下攪拌4h,至溶液清澈。配置0.5mol/L氫氧化鈉溶液,將殼聚糖溶液的PH值調(diào)至6.23,加入5mg甘露糖于殼聚糖溶液中；反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)使用0.5mol/L氫氧化鈉溶液滴加入合成溶液中,有大量沉淀析出,轉(zhuǎn)移至試管中,3000rpm/min離心,去掉上清后,依次使用蒸餾水,甲醇,乙醇洗滌2次,最后得到固體沉淀。使用蒸餾水將得到的固體沉淀完全溶解后,放入透析袋(截留分子量800),清水透析24小時(shí),再將所剩的溶液倒出培養(yǎng)皿中,進(jìn)行冷凍干燥2天。所獲得產(chǎn)物即為成功枝節(jié)甘露糖的殼聚糖。取100mmg制作好的甘露糖化殼聚糖干粉,將其溶解在蒸餾水中,配置成為濃度1mg/ml的溶液,并使用0.5m01/L的氫氧化鈉溶液將該溶液的PH調(diào)至7.48；在30℃水浴條件下配置濃度為4mg/ml的ZOL溶液,ZOL按質(zhì)量比1：3加入甘露糖化殼聚糖溶液中,室溫下攪拌30分鐘,將得到的合成產(chǎn)物分別放入透析袋(截留分子量800)中,清水透析24h,透析后所得的溶液進(jìn)行冷凍干燥2天。所得產(chǎn)物即為甘露糖化殼聚糖納米顆粒。利用熒光染料FITC結(jié)構(gòu)中的異硫氰基與甘露糖化殼聚糖納米粒中的伯胺基反應(yīng),生成對(duì)應(yīng)的取代硫脲,并用熒光掃描檢測(cè)其熒光繼發(fā)波長(zhǎng)及最大吸收波長(zhǎng)。在激光粒度分析儀下測(cè)量粒徑大��；利用納米粒攜帶的甘露糖與腫瘤組織里面TAMs細(xì)胞表達(dá)的甘露糖受體可以特異性結(jié)合的原理,將腫瘤石蠟組織切片經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)以后,加入適當(dāng)比例的不同粒徑甘露糖化殼聚糖納米粒PBS懸濁液,37℃孵育過(guò)夜,棄溶液,PBS溶液沖洗,冷凍干燥。在熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織及正常組織與納米粒的結(jié)合情況,觀察熒光染色細(xì)胞的分布以確定其結(jié)合位置,通過(guò)陽(yáng)性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)可反映出兩者結(jié)合能力的大小。最后對(duì)免疫組化結(jié)果做t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),其中將CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量視為TAMs數(shù)量,CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量視作M2巨噬細(xì)胞數(shù)量,M1巨噬細(xì)胞數(shù)量由TAMs與M2巨噬細(xì)胞數(shù)量的差值計(jì)算得出；對(duì)免疫熒光染色結(jié)果做Fisher精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果：以每高倍鏡下陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量判斷免疫組化表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度,觀察到以CD68為陽(yáng)性標(biāo)記的TAMs大量表達(dá)于人乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌癌巢、癌周組織中的細(xì)胞膜上,在乳腺、胃、大腸的正常對(duì)照組織中僅有少量表達(dá),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而肝癌組織切片TAMs表達(dá)數(shù)量顯著少于正常肝組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以CD163為陽(yáng)性標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞在受體于乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌的癌周細(xì)胞膜、胞漿中有大量表達(dá),在正常組織中極少表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝癌組織切片中M2巨噬細(xì)胞表達(dá)數(shù)量略多于正常肝組織,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算得出的肝、乳腺、胃、大腸腫瘤組織M1巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著多于正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用離子交聯(lián)法成功制備出粒徑在0.05um-1um的甘露糖化殼聚糖納米粒,其理化性質(zhì)穩(wěn)定。甘露糖化殼聚糖納米粒對(duì)組織病理切片及正常切片進(jìn)行結(jié)合處理后觀察,癌巢、腫瘤周圍5HP/每片,并對(duì)免疫熒光染色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)各腫瘤組織觀察組和正常組織對(duì)照組在納米粒免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異顯著,腫瘤組織免疫熒光染色程度均高于正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞廣泛表達(dá)于肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌的癌組織中。其中M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞在乳腺、胃、大腸腫瘤組織切片中的表達(dá)數(shù)量顯著多于正常組織；M1巨噬細(xì)胞在肝腫瘤組織中的表達(dá)數(shù)量顯著多于正常肝組織,M2巨噬細(xì)胞在肝腫瘤組織表達(dá)數(shù)量與正常肝組織無(wú)明顯差異。M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤組織與正常組織中表達(dá)數(shù)量的差異性要明顯強(qiáng)于M1型巨噬細(xì)胞；粒徑為0.05um-1um的甘露糖化殼聚糖納米粒具有與肝、乳腺、胃、大腸腫瘤組織特異性結(jié)合能力,而與腫瘤旁正常組織中少有結(jié)合,差異具有顯著性,提示甘露糖化殼聚糖納米粒具有一定的腫瘤靶向性,這將為腫瘤治療中有關(guān)治療靶點(diǎn)選擇、靶向藥物研制提供了一種新思路。
【關(guān)鍵詞】：甘露糖受體 TAMS 腫瘤 靶向治療 納米
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：