本文關鍵詞：EGFR及KRAS基因突變臨床檢測方法學比較及其影響因素分析

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【摘要】：第一章：EGFR基因突變檢測方法學比較及其影響因素分析[目的] 比較臨床常用的兩種方法檢測晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變狀態(tài)結果的差異,探討福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed paraffin embedded, FFPE)組織切片標本的不同保存方式對DNA數(shù)量、質量及對檢測結果的影響。[方法]收集中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院2010年11月至2011年8月晚期NSCLCFFPE組織切片標本150份,分別采用楔形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(Scorpions amplification refractory mutation system, ARMS)和直接測序法檢測EGFR第18、19、20、21號外顯子突變狀態(tài),分析兩種方法檢測EGFR基因突變結果的差異,對結果不一致病例收集臨床治療情況及生存數(shù)據(jù)并進行分析。對其中30份FFPE標本提取DNA并保存于-20℃ 3年,同樣的30份FFPE標本按常規(guī)方法保存3年后再提取DNA,比較兩種保存方式對DNA的數(shù)量、質量及對檢測結果的影響。[結果]Scorpions ARMS法檢測EGFR基因突變的成功率(100%)高于直接測序法(87.3%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.28,P0.05)。兩種方法檢測EGFR基因突變的一致率為87.0%,一致性較好(Kappa=0.738,P0.001)。直接測序法共檢測到7種ARMS試劑盒未包含的突變類型,其中19號外顯子E746_S747IP突變及20號外顯子H773同義突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變類型。分析結果不一致病例中5例接受靶向藥物治療后患者的生存情況,與ARMS檢測結果一致性相對較好。新鮮FFPE標本提取并貯存于-20℃ 3年的DNA與FFPE標本按常規(guī)方法保存3年后提取的DNA相比,后者質量相對較差,片段化程度更嚴重,但兩種保存方法獲取的DNA的EGFR基因突變檢測結果均一致。[結論]ARMS法對EGFR基因突變的檢測成功率較高且靈敏度較好。直接測序法可以檢測到EGFR基因的少見突變類型。FFPE標本提取DNA后低溫貯存,更有利于DNA完整性的保存。第二章：直接測序法與熒光PCR法檢測結直腸癌患者KRAS基因突變的對比分析[目的]比較直接測序法和熒光定量PCR法檢測結直腸癌KRAS基因突變狀態(tài)結果的差異,探討KRAS基因突變與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性。[方法]收集中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院2010年8月至2011年12月結直腸FFPE組織切片標本200份,分別采用直接測序法和熒光PCR法檢測KRAS基因外顯子2中第12和13號密碼子最常見的7種突變類型,將兩種方法檢測結果進行對比分析,對結果不一致病例采用蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)法(Scorpions amplification refractory mutation system,ARMS)進行驗證。同時,收集患者臨床資料,分析KRAS基因突變與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性。[結果]兩種方法檢測KRAS基因突變的總一致率為93.5%(187/200),一致性較好(Kappa=0.853,P0.05)。當Ct值小于26、介于28/29～31之間、大于31時,熒光PCR法與直接測序法一致率較高,分別為96.8%、100%、100%。當Ct值介于26～28/29之間時,熒光PCR法與直接測序法一致率較低,為0.0%。KRAS基因突變與腫瘤的T分期有關(P=0.047),KRAS 13密碼子突變與腫瘤分化程度有關(P=0.037)。[結論]在檢測前對相應腫瘤區(qū)域進行劃分,只刮取腫瘤組織進行DNA的提取,能使直接測序法檢測KRAS基因突變的結果更加準確、可靠。對于熒光PCR檢測結果圖中擴增曲線有升起但Ct值大于26的標本,建議復測或更換檢測方法進行驗證。
【關鍵詞】：肺腫瘤 表皮生長因子受體 基因突變 直接測序 楔形探針擴增阻滯突變系統(tǒng) 結直腸腫瘤 KRAS 基因突變 直接測序 熒光定量PCR
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 英文縮略詞索引6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一章 EGFR基因突變臨床檢測方法學比較及影響因素分析15-40
• 前言15-17
• 材料與方法17-28
• 一、材料17-19
• 二、方法19-28
• 結果28-33
• 1. Scorpions ARMS法檢測結果28-29
• 2. 直接測序法檢測結果29-30
• 3. Scorpions ARMS法與直接測序法結果比較30-31
• 4. 生存情況31
• 5. 樣本保存方法對DNA數(shù)量、質量及EGFR基因突變檢測結果的影響31-33
• 討論33-36
• 小結36-37
• 參考文獻37-40
• 第二章 直接測序法與熒光PCR法檢測結直腸癌患者KRAS基因突變的對比分析40-64
• 前言40-42
• 材料與方法42-53
• 一、材料42-46
• 二、方法46-53
• 結果53-58
• 1. 直接測序法檢測結果53
• 2. 熒光PCR法檢測結果53-54
• 3. 直接測序法與熒光PCR法結果比較及第三方驗證54-56
• 4. KRAS雙突變患者臨床治療及預后情況56
• 5. KRAS基因突變與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性56-58
• 討論58-61
• 小結61-62
• 參考文獻62-64
• 基金資助64-65
• 發(fā)表文章65-66
• 文獻綜述66-73
• 綜述參考文獻71-73
• 致謝73-74
• 個人簡歷74-76

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張佳年;于穎彥;計駿;劉衛(wèi)仁;吳建林;陳雪華;劉炳亞;朱正綱;;低溫凍存時間對腫瘤組織生物大分子的影響[J];診斷學理論與實踐;2009年01期

2 ;Comparative analysis of dideoxy sequencing,the KRAS StripAssay and pyrosequencing for detection of KRAS mutation[J];World Journal of Gastroenterology;2010年38期

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本文編號：1103021