本文關(guān)鍵詞：惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞lncRNAs與miRNAs的差異表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 苯并(a)芘 BEAS-2B細(xì)胞 長鏈非編碼RNA mRNA 微小RNA

【摘要】：目的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在一定范圍內(nèi)調(diào)控著生物功能的延續(xù)或中斷,其差異表達(dá)已被認(rèn)為是腫瘤的一個(gè)標(biāo)志性特征。微小RNA(microRNA,mi RNA)可負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá),且可與lncRNAs相互作用。本研究旨在探索致癌物誘導(dǎo)的永生化人支氣管上皮細(xì)胞(immortalized human bronchial epithelial,BEAS-2B)lncRNAs和miRNAs的差異表達(dá),為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供依據(jù)。方法1.以煤焦瀝青煙氣提取物(coal tar pitch extracts,CTPE)、煙草煙霧凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)為染毒物,處理BEAS-2B細(xì)胞,體外構(gòu)建細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型。以苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]為陽性對照,染毒濃度5μg/m L;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為溶劑對照,染毒濃度2‰;CTPE及CSC染毒濃度分別為2.4μg/m L與25μg/m L。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖活力及凋亡率檢測評估細(xì)胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。2.對空白對照組和分別經(jīng)B(a)P及CTPE誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B進(jìn)行LncRNA/mRNA表達(dá)譜芯片及MicroRNA表達(dá)譜芯片檢測。3.生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)lncRNAs及mi RNAs,并進(jìn)行real time-PCR驗(yàn)證。結(jié)果1.體外惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型建立BEAS-2B細(xì)胞對于CSC的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)約為0.084mg/m L。B(a)P、CTPE、CSC染毒20代、30代細(xì)胞鏡下輪廓模糊,胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,細(xì)胞膜腫脹變形,出現(xiàn)畸變的細(xì)胞核等。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B(a)P、CTPE、CSC染毒細(xì)胞遷移距離均大于DMSO組細(xì)胞(均P0.05);B(a)P、CTPE、CSC組細(xì)胞克隆形成數(shù)均高于DMSO組(均P0.05),隨代數(shù)增加,克隆形成數(shù)也增加(均P0.05);細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B(a)P、CTPE、CSC染毒細(xì)胞吸光度值均大于DMSO組(均P0.05),隨代數(shù)增加,細(xì)胞增殖活力增大(均P0.05);凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)B(a)P、CTPE、CSC染毒細(xì)胞凋亡率均小于DMSO組(均P0.05),且隨細(xì)胞代數(shù)增加,凋亡率下降(均P0.05)。2.Lnc RNA/mRNA表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果以Fold change≥1.5,P0.05進(jìn)行差異lncRNAs篩選,B(a)P 30組中檢出差異表達(dá)lncRNAs 263種,其中,較之空白對照組表達(dá)上調(diào)的有159種,下調(diào)104種;CTPE 30組中有707種lncRNAs差異表達(dá),其中,有408種表達(dá)上調(diào),299種下調(diào);且差異表達(dá)lncRNAs中antisense與intergenic兩類比例較高。以Fold change≥1.5,P0.05進(jìn)行差異mRNAs篩選,B(a)P 30組中共檢出差異表達(dá)mRNAs159種,其中,表達(dá)上調(diào)的有99種,60種下調(diào);CTPE 30組中有569種mRNAs差異表達(dá),其中,有357種上調(diào),212種下調(diào)。3.MicroRNA表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果利用Fold change≥2.0,P0.05進(jìn)行差異miRNAs篩選,B(a)P 30組中共檢出差異表達(dá)miRNAs 127種,其中,較之空白對照組表達(dá)上調(diào)的有29種,98種下調(diào);CTPE 30組中有78種mi RNAs差異表達(dá),其中,有52種表達(dá)上調(diào),26種下調(diào)。4.Real time-PCR驗(yàn)證結(jié)果與空白對照組及DMSO組相比,B(a)P、CTPE、CSC處理組lncRNAs中有ENST00000501520、ENST00000556926、ENST00000535078表達(dá)上調(diào),TCONS_00011820表達(dá)下調(diào);miRNAs中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達(dá)下調(diào)。結(jié)論CTPE、CSC可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,且隨代數(shù)增長,細(xì)胞惡性程度增加;并使LncRNA/mRNA表達(dá)譜及MicroRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。其中,參與細(xì)胞周期調(diào)控的lncRNA-ENST00000556926表達(dá)上調(diào),hsa-miR-4521表達(dá)下調(diào);參與調(diào)控細(xì)胞增殖的lncRNA-ENST00000501520表達(dá)上調(diào),hsa-miR-2115-3p表達(dá)下調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：苯并(a)芘 BEAS-2B細(xì)胞 長鏈非編碼RNA mRNA 微小RNA
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮略詞匯表9-14
• 1 引言14-17
• 2 材料與方法17-29
• 2.1 材料17-21
• 2.1.1 細(xì)胞株17
• 2.1.2 煤焦瀝青17
• 2.1.3 煙草煙霧凝集物17
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器17-19
• 2.1.5 主要試劑19-20
• 2.1.6 試劑配制20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)21
• 2.2.2 細(xì)胞染毒處理21-22
• 2.2.3 CCK-8 細(xì)胞活性檢測22-23
• 2.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)23
• 2.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.2.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活力24
• 2.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡24
• 2.2.8 TRIzol法提取細(xì)胞總RNA24-25
• 2.2.9 RNA質(zhì)量控制25
• 2.2.10 Arraystar Human LncRNA/mRNA表達(dá)譜芯片25-26
• 2.2.11 miRCURY? LNA Array micro RNA表達(dá)譜芯片26
• 2.2.12 RNA逆轉(zhuǎn)錄26-27
• 2.2.13 Real-time PCR27-28
• 2.2.14 統(tǒng)計(jì)分析28-29
• 3 結(jié)果29-60
• 3.1 細(xì)胞活性檢測確定CSC染毒濃度29-30
• 3.2 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型建立30-39
• 3.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察30-31
• 3.2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力31-34
• 3.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)34-35
• 3.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活力35-37
• 3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率37-39
• 3.3 惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞RNA表達(dá)譜芯片39-60
• 3.3.1 細(xì)胞總RNA純度及完整性測定結(jié)果39-40
• 3.3.2 Arraystar Human LncRNA/m RNA表達(dá)譜芯片結(jié)果40-54
• 3.3.3 miRCURY? LNA Array microRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果54-56
• 3.3.4 Real time-PCR驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)56-60
• 4 討論60-66
• 5. 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 綜述73-99
• 參考文獻(xiàn)90-99
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果99-100
• 致謝100

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本文編號：1101504