發(fā)布時(shí)間：2017-10-26 05:23

  本文關(guān)鍵詞：基于表面等離子體共振技術(shù)和磁性微球免疫熒光技術(shù)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的新型分析方法研究

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【摘要】：與檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的傳統(tǒng)方法相比,表面等離子體共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance,SPR)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)、在線檢測(cè),實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)需標(biāo)記,操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,而免疫磁珠(Immonumagnetic beads,IMBs)由于具有操作簡(jiǎn)單、分離速度快、分離效率高、分離過(guò)程高保真等諸多優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,在本文中,使用SPR生物傳感器對(duì)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)進(jìn)行檢測(cè),并引入生物素-鏈霉親和素納米金放大傳感信號(hào),提高了檢測(cè)的靈敏度,并以磁性微球?yàn)檩d體,結(jié)合免疫熒光,使用夾心法對(duì)CEA進(jìn)行了定性和半定量檢測(cè)。第一章:本章分別介紹了腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)意義、概念、分類及其檢測(cè)方法,對(duì)SPR技術(shù)的原理、優(yōu)點(diǎn)、檢測(cè)方法及其應(yīng)用做了簡(jiǎn)要的闡述,對(duì)免疫磁珠的組成、原理、優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用等進(jìn)行了概述,在此基礎(chǔ)上闡述了本文研究的主要內(nèi)容。第二章:基于SPR技術(shù),分別采用直接法和雙抗體夾心法對(duì)癌胚抗原進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)偶聯(lián)條件溶液pH、流速及抗體濃度進(jìn)行了考察和優(yōu)化,最后選擇在pH為4.5、流速為10μL/min、濃度為100μg/m L的條件下,對(duì)單克隆抗體mAbCEA-C3進(jìn)行偶聯(lián),偶聯(lián)量為8.475 ng?mm-2。使用直接法測(cè)CEA,檢測(cè)限為12.78 ng/mL。為了提高靈敏度,降低檢測(cè)限,使用雙抗體夾心模式對(duì)CEA進(jìn)行了檢測(cè),得到檢測(cè)限為3.3 ng/m L。與直接法相比,夾心法使靈敏度提高了4.2倍。對(duì)人血清加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測(cè),樣品回收率為102.56%~106.86%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.96%~8.99%,實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA的快速靈敏檢測(cè)。第三章:為了進(jìn)一步提高靈敏度,在使用SPR生物傳感器時(shí)引入膠體金對(duì)信號(hào)進(jìn)行二次放大。首先對(duì)鏈霉親和素(Streptavidin,SA)標(biāo)記膠體金的最小蛋白量進(jìn)行了選擇,并對(duì)吸附在納米金顆粒上的SA的量及其活性位點(diǎn)進(jìn)行了定量檢測(cè)。結(jié)果表明在1 mL膠體金上偶聯(lián)了8.5μg SA,偶聯(lián)率為42.5%,每個(gè)納米金顆粒上平均連接了11.92個(gè)SA分子,可結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為33.10個(gè),每100 nm2納米金上的SA有4.69個(gè)可結(jié)合位點(diǎn)。使用納米金增強(qiáng)的夾心法檢測(cè)CEA,SPR響應(yīng)信號(hào)和CEA濃度在1 ng/mL~60 ng/mL具有良好的線性關(guān)系,線性方程為:Y=59.8100+6.8540X(ng/m L),R2=0.9772,與夾心法相比,靈敏度提高了3.3倍。結(jié)果表明:該方法準(zhǔn)確可靠,可用于人血清中CEA的檢測(cè)。第四章:利用磁性微球結(jié)合免疫熒光對(duì)CEA進(jìn)行了定性和半定量檢測(cè)。首先使用EDC/NHS法活化磁珠上羧基使之與CEA單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián),制成免疫磁珠,用于CEA的捕獲。對(duì)樣品的洗滌次數(shù)和免疫反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,最后選擇免疫時(shí)間為45 min,洗滌三次。在優(yōu)化條件下對(duì)混合樣品中的CEA進(jìn)行捕獲,再使用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,隨著CEA濃度的增加,磁性微球表面的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA快速準(zhǔn)確的定性和半定量檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤標(biāo)志物 癌胚抗原 SPR技術(shù) 磁性微球 免疫熒光
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.4;O657
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-28
• 1.1 腫瘤標(biāo)志物概述11-16
• 1.1.1 檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的目的與意義11
• 1.1.2 腫瘤標(biāo)志物的概念與特點(diǎn)11-12
• 1.1.3 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法12-16
• 1.1.3.1 免疫分析法12-14
• 1.1.3.1.1 放射性免疫分析法12
• 1.1.3.1.2 酶聯(lián)免疫吸附分析法12-13
• 1.1.3.1.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法13-14
• 1.1.3.1.4 免疫熒光分析法14
• 1.1.3.2 免疫傳感器14-16
• 1.1.3.2.1 電化學(xué)免疫傳感器15
• 1.1.3.2.2 壓電免疫傳感器15-16
• 1.1.3.2.3 表面等離子體共振生物傳感器16
• 1.2 表面等離子體共振（SPR）技術(shù)概述16-24
• 1.2.1 SPR技術(shù)的基本原理16-17
• 1.2.2 SPR技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)17
• 1.2.3 SPR生物傳感器17-19
• 1.2.4 SPR技術(shù)的檢測(cè)方法19-21
• 1.2.5 SPR技術(shù)的應(yīng)用21-24
• 1.2.5.1 SPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用21-22
• 1.2.5.2 SPR技術(shù)在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用22-23
• 1.2.5.3 SPR技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用23-24
• 1.3 免疫磁珠概述24-27
• 1.3.1 免疫磁珠的組成24
• 1.3.2 免疫磁珠分離富集原理24-25
• 1.3.3 免疫磁珠分離富集優(yōu)勢(shì)25
• 1.3.4 免疫磁珠應(yīng)用25-27
• 1.3.4.1 免疫磁珠在食品安全中的應(yīng)用25-26
• 1.3.4.2 免疫磁珠在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用26
• 1.3.4.3 免疫磁珠在生物分離中的應(yīng)用26-27
• 1.4 本文所進(jìn)行的研究27-28
• 第2章 基于SPR技術(shù)的癌胚抗原的檢測(cè)28-38
• 2.1 前言28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分28-30
• 2.2.1 主要儀器和試劑28-29
• 2.2.2 溶液的配制29
• 2.2.3 鼠抗癌胚抗原單克隆抗體抗體偶聯(lián)條件的選擇29-30
• 2.2.4 鼠抗癌胚抗原單克隆抗體偶聯(lián)過(guò)程30
• 2.2.5 選擇芯片再生條件30
• 2.2.6 癌胚抗原的檢測(cè)30
• 2.3 結(jié)果與討論30-37
• 2.3.1 鼠抗癌胚抗原的偶聯(lián)條件30-32
• 2.3.2 鼠抗癌胚抗原的偶聯(lián)結(jié)果32-33
• 2.3.3 再生條件33
• 2.3.4 直接法檢測(cè)CEA33-35
• 2.3.5 探尋合適的mAbCEA-B5的濃度35
• 2.3.6 夾心法檢測(cè)CEA35-36
• 2.3.7 回收率實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.4 結(jié)論37-38
• 第3章 基于納米金增強(qiáng)的SPR生物傳感器檢測(cè)癌胚抗原的研究38-50
• 3.1 前言38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分38-43
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑38-39
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)原理39-40
• 3.2.3 溶液的配制40-41
• 3.2.5 鏈霉親和素修飾膠體金41-42
• 3.2.6 SA-GNPs的質(zhì)量鑒定42
• 3.2.7 納米金表面偶聯(lián)鏈霉親和素?cái)?shù)目的測(cè)定42
• 3.2.8 膠體金增強(qiáng)的夾心法檢測(cè)癌胚抗原42-43
• 3.2.9 選擇性實(shí)驗(yàn)43
• 3.3 結(jié)果與討論43-49
• 3.3.1 SA-GNPs的表征43
• 3.3.2 鏈霉親和素與膠體金結(jié)合的最小蛋白量的確定43-44
• 3.3.3 納米金表面偶聯(lián)鏈霉親和素?cái)?shù)目及活性位點(diǎn)的測(cè)定44-45
• 3.3.4 bio-mAbCEA-B5與SA-GNPs的特異性結(jié)合45-46
• 3.3.5 SA-GNPs增強(qiáng)的夾心法檢測(cè)緩沖溶液中癌胚抗原46-48
• 3.3.6 選擇性實(shí)驗(yàn)48
• 3.3.7 回收率實(shí)驗(yàn)48-49
• 3.4 結(jié)論49-50
• 第4章 基于磁性微球的免疫熒光法對(duì)癌胚抗原的檢測(cè)50-58
• 4.1 前言50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分50-54
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑50-51
• 4.2.2 溶液的配制51-52
• 4.2.3 免疫磁球的制備52
• 4.2.4 夾心熒光免疫分析法對(duì)CEA的檢測(cè)52-53
• 4.2.5 選擇性實(shí)驗(yàn)53-54
• 4.3 結(jié)果與討論54-57
• 4.3.1 免疫結(jié)合時(shí)間選擇54
• 4.3.2 洗滌次數(shù)對(duì)陰性對(duì)照的影響54-55
• 4.3.3 熒光顯微檢測(cè)與熒光強(qiáng)度分析55-57
• 4.3.4 選擇性實(shí)驗(yàn)57
• 4.4 結(jié)論57-58
• 致謝58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果66

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王佳穎;寧勇;劉湘;;表面等離子共振技術(shù)在抗原抗體相互作用中的研究[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2015年05期

2 Jing-jing WANG;Wei-hui LIU;Da CHEN;Yan XU;Lu-yin ZHANG;;A micro-machined thin film electro-acoustic biosensor for detection of pesticide residuals[J];Journal of Zhejiang University-Science C(Computers & Electronics);2014年05期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 崔香;基于功能化納米粒子的光學(xué)生物傳感體系的研究[D];陜西師范大學(xué);2013年

2 薛瑞;納米材料電化學(xué)傳感界面的構(gòu)建及農(nóng)藥殘留檢測(cè)應(yīng)用[D];北京工業(yè)大學(xué);2014年

3 雷春陽(yáng);超電荷綠色熒光蛋白在生化傳感中的研究與應(yīng)用[D];湖南大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 姚桂紅;基于納米材料放大效應(yīng)的表面等離子共振傳感器的構(gòu)建及其應(yīng)用[D];南昌大學(xué);2013年

2 張肖會(huì);SPR傳感器的構(gòu)建及對(duì)敵敵畏和莠去津的快速檢測(cè)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1097215