本文關鍵詞：HDAC2自身磷酸化對其SUMO E3連接酶活性的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景和目的：組蛋白去乙�；�(Histone deacetylases, HDACs)是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶,此酶活性結構域位于蛋白的N末端,介導組蛋白或非組蛋白的去乙酰化修飾,特別是對核小體組蛋白去除乙�；揎�,可致染色體凝聚而改變核小體結構,強力阻礙靶基因的轉錄激活,發(fā)揮靶基因轉錄沉默作用,特別是對抑癌基因、凋亡基因和分化基因的轉錄具有明顯的抑制作用,進而誘發(fā)腫瘤,被公認為有效的抗癌靶點。目前共發(fā)現(xiàn)18種HDACs,按結構和功能可分為四大類,其中Ⅰ類包括HDAC1、2、3和8,其廣泛表達于各種真核細胞內,對細胞的增殖、生長、凋亡和分化等發(fā)揮著重要的調節(jié)作用,與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。其中HDAC2高表達于結直腸癌和肺癌等多種腫瘤中,其表達高低與腫瘤的預后明顯相關,抑制HDAC2的活性或表達可顯著抑制結直腸癌細胞的增殖和生長,并促進癌細胞凋亡。然而,研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)應用去乙�；敢种苿┖�,可誘發(fā)皮膚T細胞淋巴瘤、結直腸癌和肺癌細胞產生獲得性耐藥,但其耐藥機制仍不清楚。但若將HDAC抑制劑與mTOR通路抑制劑sirolimus聯(lián)合應用,則能協(xié)同增強HDAC抑制劑對結直腸癌的殺瘤效應。由此提示HDAC2在結直腸癌和肺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中起重要作用,但其作用機制仍不清楚。另外,我們前期研究還發(fā)現(xiàn),HDAC2除具有去乙�；�,直接下調核小體組蛋白的乙�；揎�,沉默p53、p21、Bax和NOXA等抗細胞增殖和促凋亡相關基因的表達,或者直接去除這些蛋白乙�；揎�,在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用外；其還具有SUMO E3連接酶活性,且通過此功能介導,其可上調翻譯起始因子eIF4E的SUMO化修飾,激活帽依賴性mRNA的翻譯,上調促細胞增殖和抗細胞凋亡相關基因如ODC、C-myc、Survivin和Bcl-2的表達,在結直腸癌細胞增殖和凋亡調控中發(fā)揮重要作用。然而,盡管我們發(fā)現(xiàn)并證實HDAC2具有SUMO E3連接酶新功能,且證實此新功能可通過調節(jié)真核翻譯起始因子eIF4E的SUMO化修飾,而激活帽依賴性mRNA的翻譯,但HDAC2的SUMO E3連接酶新功能的生物學意義仍不清楚,特別是此新功能如何協(xié)同其去乙�；富钚�,通過轉錄沉默和翻譯激活而選擇性調控有利于腫瘤發(fā)生、增殖、生長和凋亡相關基因的表達,在結直腸癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮重要作用的機制仍不得而知。并提示,單純阻斷HDAC2的去乙�；富钚詫δ[瘤的治療存在缺陷,這也可能是腫瘤耐藥的主要原因。為此我們認為HDAC2雙酶活性協(xié)同抑制策略可能對腫瘤的治療具有更好的療效。然而,目前所有靶向HDAC2的抗腫瘤藥物均是針對去乙�；富钚远O計,而針對SUMO E3連接酶的抑制劑仍待研發(fā)。而要設計研發(fā)靶向HDAC2 SUMO E3連接酶活性的抑制劑,我們首先必須了解此酶的活化調控機制。HDACs的活性受到多種機制的調控,包括翻譯后修飾、亞細胞定位和輔阻遏蛋白質復合物相互作用。其中,翻譯后修飾不僅直接影響HDACs的活性,而且影響其亞細胞定位和蛋白質復合物相互作用,從而間接調控其轉錄抑制活性。翻譯后修飾方式主要包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化等,其中磷酸化是HDAC2的主要翻譯后修飾方式,存在于羧基端的S394、S407、S411、S422和S424等5個絲氨酸位點可被磷酸化修飾。另外,分析發(fā)現(xiàn)HDAC2的磷酸化修飾區(qū)域正好位于其SUMO E3連接酶的結構域內,且磷酸化修飾和SUMO修飾之間存在密切的聯(lián)系。為此,我們推測HDAC2的自身磷酸化在其SUMO E3連接酶功能的發(fā)揮中起重要的調節(jié)作用,但有待證實。在體內磷酸化修飾HDAC2的激酶主要是CKⅡ,CKⅡ也可在體內外介導HDAC2394、422和424位絲氨酸的磷酸化修飾。與此相一致,CKⅡ也可介導HDAC1的磷酸化修飾,且突變HDAC1磷酸化位點S421A、S423A而消除其磷酸化修飾,反而促進HDAC1的SUMO化修飾。由此提示,CKⅡ介導的HDAC2自身磷酸化修飾也可能與其自身SUMO化修飾之間存在必然的聯(lián)系,而HDAC2自身SUMO化修飾是其發(fā)揮SUMO E3連接酶活性的基礎。然而,關于CK2介導的HDAC2磷酸化修飾對其自身SUMO E3連接酶活性的調控作用還未見報道。為此,本研究將主要采用基因點突變技術,初步探討HDAC2自身磷酸化對其SUMOE3連接酶的影響和作用,并明確磷酸化修飾對HDAC2 SUMO E3連接酶的調節(jié)機制,為進一步設計研發(fā)靶向抑制HDAC2 SUMO E3連接酶活性的抗癌新藥奠定基礎。方法：本研究將首先通過基因點突變和片段缺失突變技術,構建HDAC2已知磷酸化位點S394A、S407A、S411A、S422A和S424A的磷酸化位點突變體和片段缺失突變體,后應用反應HDAC2 SUMO E3連接酶活性報告基因實驗鑒定直接去除這些位點磷酸化對其活性的影響和作用；其次再應用CK2激酶的抑制劑四溴苯并三唑(TBB),阻斷CK2的活性,證實間接減弱HDAC2的自身磷酸化修飾對HDAC2 SUMO E3連接酶活性的影響和作用；第三,在上述基礎上,通過生物信息學分析HDAC2是否存在新的磷酸化修飾位點,后進一步構建HDAC2新磷酸化位點的突變體,后再應用研究報告基因實驗、Western-blot實驗和細胞增殖實驗等探討HDAC2特定位點的磷酸化修飾對其SUMO E3連接酶活性的影響、機制和生物學意義。結果：1.成功構建了HDAC2的已知磷酸化區(qū)域缺失及五個磷酸化位點的負性突變體的真核表達載體。2.報告基因實驗證實,HDAC2的已知磷酸化區(qū)域缺失突變不影響其SUMO E3連接酶活性,HDAC2的五個已知絲氨酸的磷酸化對其SUMO E3連接酶的活性也不起調節(jié)作用。3.CK2的抑制劑四溴苯并三唑(TBB)能抑制CK2介導的HDAC2的自身磷酸化修飾,且此抑制劑對HDAC2介導的帽依賴性翻譯報告基因LUC的表達起負向調節(jié)作用。4.生物信息學預測分析發(fā)現(xiàn)HDAC2的T477和T480位點是兩個潛在的自身磷酸化位點,且與野生型相比,T477此位點的磷酸化負性突變體顯著增加HDAC2的SUMO E3連接酶反應性報告基因的表達,是野生型的4.24倍,由此提示此位點的磷酸化修飾負性調節(jié)HDAC2的SUMO E3連接酶活性。5. IP、western blot和細胞增殖實驗證實,HDAC2 T477A的磷酸化負性突變體顯著增加HDAC2的自身SUMO化和eIF4E的SUMO化修飾,在翻譯水平增強eIF4E調控的靶蛋白(如Bcl-2、cyclin D1、C-myc、Survivin和ODC等)翻譯的增加,并促進結腸細胞的增殖。結論：HDAC2的自身磷酸化參與了其SUMO E3連接酶活性的調節(jié),此調節(jié)機制與HDAC2的T477位點的磷酸化相關,而與S394、S407、S411、S422和S424五個位點的磷酸化無關。同時,HDAC2 T477的磷酸化對其SUMO E3連接酶的的活性調節(jié)為負性調節(jié),即HDAC2 T477A的突變體能顯著增強HDAC2自身SUMO化修飾、eIF4E的SUMO化修飾,以及在翻譯水平提高eIF4E介導的靶蛋白Bcl-2、cyclin D1、C-myc、 Survivin和ODC表達的增加,并促進結腸癌細胞的增殖。
【關鍵詞】：結、直腸腫瘤 HDAC2 磷酸化修飾 小泛素樣修飾 E3連接酶
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 英文縮略表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 構建HDAC2磷酸化區(qū)域缺失和位點負性突變體真核表達載體17-33
• 2.1 材料17-20
• 2.2 方法20-28
• 2.3 結果28-31
• 2.4 討論31-32
• 2.5 小結32-33
• 第三章 HDAC2自身磷酸化修飾對其SUMO E3連接酶活性的調節(jié)作用研究33-41
• 3.1 材料33-35
• 3.2 方法35-37
• 3.3 結果37-38
• 3.4 討論38-40
• 3.5 小結40-41
• 第四章 新磷酸化位點的預測、負性突變體的構建及其功能鑒定41-54
• 4.1 材料41-43
• 4.2 方法43-47
• 4.3 結果47-51
• 4.4 討論51-52
• 4.5 小結52-54
• 全文總結54-55
• 參考文獻55-59
• 文獻綜述 HDAC2的翻譯后修飾研究進展59-74
• 參考文獻67-74
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文74-75
• 致謝75

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 黃浩;張還添;潘京華;查振剛;;骨關節(jié)炎的表觀遺傳學研究進展[J];廣東醫(yī)學;2014年02期

2 宗實;劉蓉;史娟娟;王s，

本文編號：1086239