本文關(guān)鍵詞：LncRNA-Hh通過調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路促進(jìn)Twist陽性乳癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的富集及干性維持

  更多相關(guān)文章： LncRNA 腫瘤干細(xì)胞 乳腺癌 Hedgehog信號(hào)通路

【摘要】：目的探討lncRNAs在Twist誘導(dǎo)的EMT化乳癌細(xì)胞中促腫瘤干細(xì)胞的富集及干性維持的作用和分子病理機(jī)制。方法(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法構(gòu)建Twist基因穩(wěn)定表達(dá)的MCF-7/Twist人上皮樣乳癌細(xì)胞,Western blotting、細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)。(2) mammospheres形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7/Twist細(xì)胞和MCF-7/Vector細(xì)胞mammosphere形成能力,qRT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)富集得到的mammospheres中Twist及CSC標(biāo)記物的表達(dá)情況；mammospheres連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞自我更新能力、增殖能力和遷移能力。(3)應(yīng)用人Agilent lncRNA芯片檢測(cè)MCF-7/Vector細(xì)胞和MCF-7/Twist細(xì)胞來源的CSC樣細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)譜,qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芯片結(jié)果。(4)生物信息學(xué)方法分析MCF-7/Twist細(xì)胞來源的CSC樣細(xì)胞異常lncRNAs的靶向mRNAs,結(jié)合mRNAs芯片數(shù)據(jù),分析異常的信號(hào)通路,Western blot驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路活化情況。(5)在Twist陽性的乳腺癌細(xì)胞株Hs578T和BT549中,特異靶向敲除Twist基因、特異抑制劑GDC-0449阻斷Hedgehog信號(hào)通路檢測(cè)細(xì)胞的mammosphere形成能力、CSC標(biāo)記物的表達(dá)情況和Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子GLI 1的活化情況。(6)生物信息學(xué)及定量PCR方法確定Hedgehog信號(hào)通路特異相關(guān)lncRNA(lncRNA-Hh)。(7) qRT-PCR方法檢測(cè)lncRNA-Hh與轉(zhuǎn)錄因子Twist的關(guān)系,熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA-Hh的轉(zhuǎn)錄活性。(8)慢病毒感染法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)lncRNA-Hh的MCF-7細(xì)胞株、特異靶向干擾lncRNA-Hh的Hs578T, Hs578T乳腺癌細(xì)胞株,檢測(cè)細(xì)胞的mammosphere形成情況、CSC標(biāo)記物(SOX2,OCT4)的表達(dá)情況、Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子GLI1的活化和lncRNA-Hh靶基因蛋白GAS1的表達(dá)。(9)裸鼠皮下成瘤模型明確lncRNA-Hh是否促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤,qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GAS1、SOX2、GLI1和OCT4在瘤體組織中的表達(dá)。結(jié)果(1)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Twist成功誘導(dǎo)上皮樣乳癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。(2)EMT化的MCF-7細(xì)胞促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的富集,mammosphere小球數(shù)量多、體積大,且具有更強(qiáng)的自我更新、增殖和遷移能力。(3)lncRNAs芯片結(jié)果顯示有462個(gè)異常表達(dá)的lncRNAs(差異倍數(shù)5倍以上),其中有270個(gè)上調(diào)的lncRNAs和172個(gè)下調(diào)的lncRNAs,2065個(gè)異常表達(dá)的mRNAs(差異倍數(shù)1.5倍以上)。生物信息學(xué)方法分析顯示462個(gè)異常表達(dá)的lncRNAs(差異倍數(shù)5倍以上)預(yù)測(cè)得到的靶基因有797個(gè)。(4)信號(hào)通路富集度分析結(jié)果顯示,Hedgehog、Wnt、MAPK、TGF-β和Notch等與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路被異�；罨-value值最高的Hedgehog信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子sHh和GLI1的活化明顯增強(qiáng)。(5)特異靶向敲除Twist基因或特異抑制劑GDC-0449阻斷Hedgehog信號(hào)通路,減弱mammosphere形成、CSC標(biāo)記物的表達(dá)下調(diào)和GLI1的活化減弱。(6)生物信息學(xué)及qRT-PCR方法確定了Hedgehog信號(hào)通路特異相關(guān)lncRNA為lncRNA (chr9,89563614-89616948,+)(命名為lncRNA-Hh)。(7) qRT-PCR方法和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示Hedgehog信號(hào)通路特異相關(guān)lncRNA-Hh受轉(zhuǎn)錄因子Twist的調(diào)控。(8) lncRNA-Hh促進(jìn)Twist陽性乳腺癌細(xì)胞mammosphere形成、CSC標(biāo)記物(SOX2,OCT4)的表達(dá)、GLI1的活化和靶基因蛋白GAS1的表達(dá)。(9)lncRNA-Hh促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞CSC樣細(xì)胞的體內(nèi)成瘤,促進(jìn)GAS1、SOX2、GLI1和OCT4在瘤體組織中的表達(dá)。結(jié)論在Twist誘導(dǎo)的EMT轉(zhuǎn)化和Twist陽性的乳腺上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA(如lncRNA-Hh)作為重要的新型調(diào)控因子參與調(diào)控CSC相關(guān)信號(hào)通路(如Hedgehog信號(hào)通路)的活化,從而促進(jìn)CSC富集、自我更新和體內(nèi)成瘤。
【關(guān)鍵詞】：LncRNA 腫瘤干細(xì)胞 乳腺癌 Hedgehog信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-16
• 1 材料與方法16-26
• 1.1 材料16-20
• 1.1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒和菌株16-17
• 1.1.2 主要試劑及耗材17-18
• 1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備18
• 1.1.4 溶液的配制18-20
• 1.2 方法20-26
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 1.2.2 穩(wěn)定篩選細(xì)胞株的構(gòu)建20-21
• 1.2.3 Mammosphere細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)21-22
• 1.2.4 Real time PCR定量分析22-24
• 1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)24-25
• 1.2.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)25
• 1.2.7 LncRNA芯片分析25
• 1.2.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)25-26
• 1.2.9 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)26
• 1.2.10 免疫組織化學(xué)染色26
• 1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析26
• 2 結(jié)果26-32
• 2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Twist誘導(dǎo)上皮樣乳癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化26-27
• 2.2 EMT轉(zhuǎn)化后的MCF-7細(xì)胞懸浮培養(yǎng)成球能力的變化27
• 2.3 EMT化后的CSC樣細(xì)胞與對(duì)照CSC樣細(xì)胞之間的功能差異27-28
• 2.4 MCF-7/Twist和MCF-7/Vector中CSC樣細(xì)胞LncRNA芯片分析28
• 2.5 MCF-7/Twist細(xì)胞中CSC樣細(xì)胞異常表達(dá)lncRNAs靶向mRNAs及異常表達(dá)mRNAs生物信息學(xué)分析28-29
• 2.6 MCF-7/Twist細(xì)胞中CSC樣細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路活化的驗(yàn)證29
• 2.7 Hedgehog信號(hào)通路異�；罨瘜�(duì)Twist陽性的乳腺癌細(xì)胞中CSC樣細(xì)胞富集及特性的維持的影響29-30
• 2.8 Hedgehog信號(hào)通路特異相關(guān)lncRNA的確定30
• 2.9 Hedgehog信號(hào)通路特異相關(guān)lncRNA-Hh與轉(zhuǎn)錄因子Twist的關(guān)系30-31
• 2.10 Hedgehog信號(hào)通路特異相關(guān)lncRNA-Hh受轉(zhuǎn)錄因子Twist的調(diào)控31
• 2.11 lncRNA-Hh對(duì)乳腺癌細(xì)胞CSC樣細(xì)胞富集及特性的維持的影響31-32
• 2.12 lncRNA-Hh促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞CSC樣細(xì)胞的體內(nèi)成瘤32
• 3 討論32-35
• 全文總結(jié)35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 附圖40-54
• 文獻(xiàn)綜述54-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 致謝62-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫的學(xué)術(shù)論文63-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間參與的科研項(xiàng)目65

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本文編號(hào)：1081722