本文關鍵詞：LncRNA-Hh通過調控Hedgehog信號通路促進Twist陽性乳癌干細胞樣細胞的富集及干性維持

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【摘要】：目的探討lncRNAs在Twist誘導的EMT化乳癌細胞中促腫瘤干細胞的富集及干性維持的作用和分子病理機制。方法(1)逆轉錄病毒感染法構建Twist基因穩(wěn)定表達的MCF-7/Twist人上皮樣乳癌細胞,Western blotting、細胞免疫熒光法檢測EMT標志蛋白的表達。(2) mammospheres形成實驗檢測MCF-7/Twist細胞和MCF-7/Vector細胞mammosphere形成能力,qRT-PCR、Western blot和細胞免疫熒光實驗檢測富集得到的mammospheres中Twist及CSC標記物的表達情況；mammospheres連續(xù)傳代實驗、細胞計數(shù)和transwell遷移實驗檢測腫瘤干細胞自我更新能力、增殖能力和遷移能力。(3)應用人Agilent lncRNA芯片檢測MCF-7/Vector細胞和MCF-7/Twist細胞來源的CSC樣細胞中l(wèi)ncRNAs的表達譜,qRT-PCR實驗驗證芯片結果。(4)生物信息學方法分析MCF-7/Twist細胞來源的CSC樣細胞異常lncRNAs的靶向mRNAs,結合mRNAs芯片數(shù)據(jù),分析異常的信號通路,Western blot驗證相關信號通路活化情況。(5)在Twist陽性的乳腺癌細胞株Hs578T和BT549中,特異靶向敲除Twist基因、特異抑制劑GDC-0449阻斷Hedgehog信號通路檢測細胞的mammosphere形成能力、CSC標記物的表達情況和Hedgehog信號通路關鍵信號分子GLI 1的活化情況。(6)生物信息學及定量PCR方法確定Hedgehog信號通路特異相關lncRNA(lncRNA-Hh)。(7) qRT-PCR方法檢測lncRNA-Hh與轉錄因子Twist的關系,熒光素酶報告實驗檢測lncRNA-Hh的轉錄活性。(8)慢病毒感染法構建穩(wěn)定表達lncRNA-Hh的MCF-7細胞株、特異靶向干擾lncRNA-Hh的Hs578T, Hs578T乳腺癌細胞株,檢測細胞的mammosphere形成情況、CSC標記物(SOX2,OCT4)的表達情況、Hedgehog信號通路關鍵信號分子GLI1的活化和lncRNA-Hh靶基因蛋白GAS1的表達。(9)裸鼠皮下成瘤模型明確lncRNA-Hh是否促進乳腺癌細胞的體內成瘤,qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學染色實驗檢測GAS1、SOX2、GLI1和OCT4在瘤體組織中的表達。結果(1)轉錄調控因子Twist成功誘導上皮樣乳癌細胞MCF-7發(fā)生EMT轉化。(2)EMT化的MCF-7細胞促進腫瘤干細胞樣細胞的富集,mammosphere小球數(shù)量多、體積大,且具有更強的自我更新、增殖和遷移能力。(3)lncRNAs芯片結果顯示有462個異常表達的lncRNAs(差異倍數(shù)5倍以上),其中有270個上調的lncRNAs和172個下調的lncRNAs,2065個異常表達的mRNAs(差異倍數(shù)1.5倍以上)。生物信息學方法分析顯示462個異常表達的lncRNAs(差異倍數(shù)5倍以上)預測得到的靶基因有797個。(4)信號通路富集度分析結果顯示,Hedgehog、Wnt、MAPK、TGF-β和Notch等與腫瘤干細胞相關的經典信號通路被異�；罨-value值最高的Hedgehog信號通路中的關鍵信號分子sHh和GLI1的活化明顯增強。(5)特異靶向敲除Twist基因或特異抑制劑GDC-0449阻斷Hedgehog信號通路,減弱mammosphere形成、CSC標記物的表達下調和GLI1的活化減弱。(6)生物信息學及qRT-PCR方法確定了Hedgehog信號通路特異相關lncRNA為lncRNA (chr9,89563614-89616948,+)(命名為lncRNA-Hh)。(7) qRT-PCR方法和熒光素酶報告實驗顯示Hedgehog信號通路特異相關lncRNA-Hh受轉錄因子Twist的調控。(8) lncRNA-Hh促進Twist陽性乳腺癌細胞mammosphere形成、CSC標記物(SOX2,OCT4)的表達、GLI1的活化和靶基因蛋白GAS1的表達。(9)lncRNA-Hh促進乳腺癌細胞CSC樣細胞的體內成瘤,促進GAS1、SOX2、GLI1和OCT4在瘤體組織中的表達。結論在Twist誘導的EMT轉化和Twist陽性的乳腺上皮細胞中l(wèi)ncRNA(如lncRNA-Hh)作為重要的新型調控因子參與調控CSC相關信號通路(如Hedgehog信號通路)的活化,從而促進CSC富集、自我更新和體內成瘤。
【關鍵詞】：LncRNA 腫瘤干細胞 乳腺癌 Hedgehog信號通路
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-16
• 1 材料與方法16-26
• 1.1 材料16-20
• 1.1.1 細胞株、質粒和菌株16-17
• 1.1.2 主要試劑及耗材17-18
• 1.1.3 主要實驗設備18
• 1.1.4 溶液的配制18-20
• 1.2 方法20-26
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)20
• 1.2.2 穩(wěn)定篩選細胞株的構建20-21
• 1.2.3 Mammosphere細胞功能實驗21-22
• 1.2.4 Real time PCR定量分析22-24
• 1.2.5 Western blot實驗24-25
• 1.2.6 細胞免疫熒光實驗25
• 1.2.7 LncRNA芯片分析25
• 1.2.8 熒光素酶報告實驗25-26
• 1.2.9 裸鼠體內成瘤實驗26
• 1.2.10 免疫組織化學染色26
• 1.2.11 統(tǒng)計分析26
• 2 結果26-32
• 2.1 轉錄調控因子Twist誘導上皮樣乳癌細胞MCF-7發(fā)生EMT轉化26-27
• 2.2 EMT轉化后的MCF-7細胞懸浮培養(yǎng)成球能力的變化27
• 2.3 EMT化后的CSC樣細胞與對照CSC樣細胞之間的功能差異27-28
• 2.4 MCF-7/Twist和MCF-7/Vector中CSC樣細胞LncRNA芯片分析28
• 2.5 MCF-7/Twist細胞中CSC樣細胞異常表達lncRNAs靶向mRNAs及異常表達mRNAs生物信息學分析28-29
• 2.6 MCF-7/Twist細胞中CSC樣細胞Hedgehog信號通路活化的驗證29
• 2.7 Hedgehog信號通路異�；罨瘜wist陽性的乳腺癌細胞中CSC樣細胞富集及特性的維持的影響29-30
• 2.8 Hedgehog信號通路特異相關lncRNA的確定30
• 2.9 Hedgehog信號通路特異相關lncRNA-Hh與轉錄因子Twist的關系30-31
• 2.10 Hedgehog信號通路特異相關lncRNA-Hh受轉錄因子Twist的調控31
• 2.11 lncRNA-Hh對乳腺癌細胞CSC樣細胞富集及特性的維持的影響31-32
• 2.12 lncRNA-Hh促進乳腺癌細胞CSC樣細胞的體內成瘤32
• 3 討論32-35
• 全文總結35-36
• 參考文獻36-40
• 附圖40-54
• 文獻綜述54-62
• 參考文獻58-62
• 致謝62-63
• 攻讀碩士學位期間撰寫的學術論文63-65
• 攻讀碩士學位期間參與的科研項目65

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