發(fā)布時(shí)間：2017-10-22 19:29

  本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用及相關(guān)機(jī)制

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【摘要】：目的：近期研究顯示,產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)對(duì)Claudin-4蛋白(CL4)高表達(dá)的前列腺癌、卵巢癌等顯示出毒性殺傷作用,對(duì)胃癌的研究尚屬空白。本課題通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn),研究CPE對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用及相關(guān)機(jī)制。方法：1.臨床評(píng)估：將胃癌組織(30例)、癌旁組織(30例)、正常胃粘膜標(biāo)本(30例)進(jìn)行緊密連接蛋白Claudin-4 (CL4)的免疫組化染色,并按1分～5分對(duì)免疫組化片子評(píng)分,評(píng)估三組標(biāo)本CL4蛋白的表達(dá)情況。2.CPE制備：首先合成Clostridiun perfringens SM101 CPE基因序列,并構(gòu)建正確的Pet28a-CPE表達(dá)載體質(zhì)粒。然后用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a,常溫培養(yǎng)被成功轉(zhuǎn)染的大腸桿菌并用IPTG誘導(dǎo)CPE融合蛋白表達(dá),產(chǎn)物以Ni-IDA純化,獲得純化的CPE蛋白。3.體外實(shí)驗(yàn)：以人胃癌細(xì)胞株SGC7901及正常胃粘膜細(xì)胞株GES-1為研究對(duì)象,采用不同濃度的CPE分別作用于SGC7901和GES-1,MTT法檢測(cè)CPE處理后各組細(xì)胞活性,Western Blot及激光共聚焦法檢測(cè)CPE處理前后兩組細(xì)胞CL4蛋白的表達(dá)分布情況。采用siRNA沉默CL4的表達(dá),再次用MTT檢測(cè)CPE處理后兩組細(xì)胞的活性。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：首先用SGC7901細(xì)胞瘤塊種植于裸鼠皮下的方法建立胃癌皮下移植瘤模型。將28只模型裸鼠隨機(jī)平均分為4組(每組7只)：對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。成瘤后每天分別皮下注射對(duì)應(yīng)濃度的藥物100μL,對(duì)照組注射100μL的PBS,連續(xù)注射10天。監(jiān)測(cè)各組裸鼠生長(zhǎng)狀況、體重、死亡率及腫瘤體積。選取副作用較小且有治療作用的藥物濃度,將14只模型裸鼠分為2組：對(duì)照組和CPE處理組,進(jìn)一步重復(fù)實(shí)驗(yàn),監(jiān)測(cè)兩組裸鼠腫瘤體積變化情況。結(jié)果：1.CL4在胃癌患者的癌組織表達(dá)陽(yáng)性率為66.7%,在癌旁組織中的陽(yáng)性率為46.7%,均顯著高于正常組織的16.7%。2.構(gòu)建的CPE載體質(zhì)粒Pet28a-CPE經(jīng)測(cè)序檢測(cè),目的片段與基因庫(kù)序列基本一致。WB驗(yàn)證感受態(tài)大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物分子量約35×103,與其余文獻(xiàn)報(bào)道吻合。產(chǎn)物經(jīng)分析純度為98%以上,濃度約為10mg/mL。3.在體外實(shí)驗(yàn)中,CPE對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901具有明顯的毒性作用。在CPE(0.2mg/L～10mg/L)作用24小時(shí)后,MTT可檢測(cè)出胃癌細(xì)胞SGC7901的細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組,其毒性呈劑量依賴。將CL4蛋白沉默后,可看出CPE對(duì)SGC7901細(xì)胞的殺傷效果明顯降低。CPE對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1無(wú)明顯毒性作用。進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn),SGC7901細(xì)胞及GES-1細(xì)胞均表達(dá)CL4,GES-1的相對(duì)表達(dá)量顯著低于SGC7901。激光共聚焦顯示,GES-1細(xì)胞可形成穩(wěn)定緊密連接。經(jīng)CPE處理后,SGC7901細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞,而GES-1可維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整性。4在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,可觀察到20mg/L的CPE對(duì)SGC7901皮下移植瘤具有抑制生長(zhǎng)作用,且有腸出血,注射部位皮膚壞死等并發(fā)癥。而當(dāng)CPE劑量大于30mg/L時(shí),會(huì)引起裸鼠在用藥第三天開始死亡。結(jié)論：產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素CPE對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞具有殺傷作用,其毒性作用需通過(guò)CL4蛋白介導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 CPE Claudin-4 緊密連接
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文縮略詞表11-12
• 前言12-18
• 1. 胃癌與緊密連接12-13
• 2. 產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)13-15
• 3. CPE在惡性腫瘤治療中的相關(guān)研究15-17
• 4. 本課題的研究目的及意義17-18
• 實(shí)驗(yàn)材料與儀器18-20
• 1. 主要實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)儀器與器械19-20
• 方法20-23
• 1. CPE制備20
• 2. 細(xì)胞培養(yǎng)、復(fù)蘇及凍存20
• 3. 免疫組化20-21
• 4. WB驗(yàn)證Claudin-4在SGC7901細(xì)胞及GES-1細(xì)胞中的表達(dá)21
• 5. MTT法檢測(cè)不同濃度CPE對(duì)SGC7901和GES-1細(xì)胞毒性21-22
• 6. 激光共聚焦檢測(cè)CL4在SGC7901細(xì)胞及GES-1細(xì)胞上的表達(dá)22
• 7. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)22
• 8. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理22-23
• 結(jié)果23-33
• 1. 30例胃癌患者癌組織及癌旁組織Claudin-4表達(dá)情況及評(píng)分23-24
• 2. CPE的制備24-25
• 3. CPE對(duì)SGC7901細(xì)胞毒性研究25-30
• 4. CPE對(duì)胃癌裸鼠皮下移植模型的治療作用30-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 綜述43-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 碩士期間發(fā)表的文章56-57
• 致謝57-58

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