發(fā)布時間：2017-10-21 10:05

  本文關鍵詞：人B7-H4受體及其抗體的檢測和研究

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【摘要】：B7-H4又稱為B7x或B7S1,是近來發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員,在T細胞介導的免疫應答中起著重要的負性調(diào)節(jié)的作用。B7-H4的mRNA廣泛表達于人的外周組織,包括胎盤、肝臟、骨骼肌、腎臟等,而B7-H4蛋白在細胞表面的表達是受限的。研究發(fā)現(xiàn)B7-H4在多種腫瘤組織中表達,包括肺癌、卵巢癌、胃癌等,其被認為是一種腫瘤標志物,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前,B7-H4受體尚未被克隆,Sica等通過構建B7-H4.Ig融合蛋白,采用流式細胞技術分離健康人新鮮T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)B7-H4.Ig不能與其結合,但經(jīng)過體外活化刺激后約有20%-30%的結合,證實在活化T細胞上有B7-H4受體的表達。目前雖不清楚B7-H4與活化T細胞上B7-H4受體是如何相互作用改變信號通路下調(diào)T細胞的活化、增殖與細胞因子的分泌,但已有文獻報道,B7-H4分子與其受體結合后可抑制ERK、JNK、p38、AKT等分子活性,進而影響T細胞的活化。本科室采用B7-H4-Fc融合蛋白進行流式細胞檢測,在肺癌組織浸潤的T細胞、肺癌細胞轉(zhuǎn)移的淋巴結來源的T淋巴細胞、炎癥組織浸潤的扁桃體細胞上檢測到B7-H4受體的表達。本研究將通過采用Magrose-NHS磁珠和構建溴化氫活化瓊脂糖4B親和層析柱,從扁桃體、Jurkat細胞中分離純化B7-H4受體蛋白并對其鑒定。利用免疫組化、免疫熒光檢測B7-H4受體在Jurkat細胞和炎癥浸潤的扁桃體中的表達及定位,為以后探索B7-H4受體分子在腫瘤浸潤T細胞上的表達打下基礎。一、人B7-H4受體的分離與鑒定【目的】大量純化B7-H4受體并對其檢測,為以后研究B7-H4受體分子提供基礎�！痉椒ā客ㄟ^采用Magrose-NHS磁珠和構建溴化氫活化瓊脂糖4B親和層析柱,從扁桃體細胞、Jurkat細胞中分離純化B7-H4受體蛋白,通過SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色和脫色,觀察目的蛋白條帶。將洗脫蛋白包板,利用ELISA鑒定純化蛋白中是否含有B7-H4受體�！窘Y果】采用Magrose-NHS磁珠從扁桃體細胞裂解上清中成功分離純化出B7-H4受體,經(jīng)SDS-PAGE考染后條帶位于170KD上方,將洗脫蛋白包板,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)與B7-H4-Fc-Bio、10A10-Bio反應為陽性(P0.05)。成功構建溴化氫活化瓊脂糖4B-10A10層析柱,大量分離純化B7-H4受體,經(jīng)SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色后在170KD上方發(fā)現(xiàn)目標蛋白,將洗脫蛋白包板后,利用ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)同樣與B7-H4-Fc-Bio、10A10-Bio均有陽性結果,經(jīng)Graph Pad Prism分析,P0.05,有統(tǒng)計學意義。因此,洗脫蛋白中含有B7-H4受體�！窘Y論】采用Magrose-NHS磁珠和溴化氫活化瓊脂糖4B-10A10親和層析柱均分離純化得到B7-H4受體蛋白,為進一步研究B7-H4受體生物學功能奠定基礎。二、利用B7-H4受體的抗體10A10檢測B7-H4受體在細胞和組織中的表達【目的】本研究通過分析B7-H4受體在Jurkat細胞和炎癥浸潤的扁桃體細胞中的表達及定位,為以后探索B7-H4受體分子在腫瘤浸潤T細胞上的表達打下基礎�！痉椒ā恐苽浔馓殷w冰凍切片,利用免疫組化、免疫熒光檢測Jurkat細胞、扁桃體分選出的部分淋巴細胞和扁桃體冰凍切片中B7-H4受體的表達及定位�！窘Y果】組化結果顯示,在Jurkat細胞、扁桃體分選出的部分淋巴細胞膜表面有散在分布的棕色區(qū)域。扁桃體冰凍切片中,有陽性棕色顆粒呈彌散型分布。免疫熒光結果顯示,Jurkat細胞、扁桃體分選出的部分B淋巴細胞膜和扁桃體冰凍切片中均呈現(xiàn)紅色熒光,與陰性有強烈的對比�！窘Y論】B7-H4受體在Jurkat細胞、扁桃體分選出淋巴細胞和扁桃體冰凍切片中均有分布,且定位在細胞的細胞膜上。
【關鍵詞】：B7-H4 B7-H4受體 SDS-PAGE 免疫組化 免疫熒光
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.43
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 研究背景10-24
• 1. B7-H4分子的結構特征11-12
• 2. B7-H4分子表達特征12-13
• 3. B7-H4對T細胞的抑制13
• 4. B7-H4的潛在機制和信號通路13-15
• 5. B7-H4在腫瘤微環(huán)境中的作用15-16
• 6. B7-H4分子在腫瘤組織上的表達16-19
• 7. B7-H4分子受體的研究進展19-20
• 參考文獻20-24
• 第一部分 人B7-H4受體的分離與鑒定24-39
• 1. 實驗試劑與材料24-26
• 2. 實驗方法26-30
• 3. 實驗結果30-36
• 討論36-37
• 參考文獻37-39
• 第二部分 利用B7-H4受體的單抗 10A10檢測B7-H4受體在細胞和組織中的表達39-46
• 1. 材料與儀器39-40
• 2. 實驗方法40-41
• 3. 實驗結果41-43
• 討論43-45
• 參考文獻45-46
• 總結與展望46-47
• 英文縮略詞表47-49
• 致謝49-50

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本文編號：1072715