本文關(guān)鍵詞：自噬對甲狀腺未分化癌發(fā)病機制及放化療增敏作用的研究

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【摘要】：自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞面對缺氧、饑餓、電離輻射、化學(xué)藥物等其他外界刺激時，就會誘導(dǎo)自噬發(fā)生，進(jìn)而激活自噬相關(guān)信號通路。研究報道甲狀腺腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下（如：電離輻射或化學(xué)藥物等）能夠觸發(fā)自噬，而自噬相關(guān)PI3K-AKT-mTOR信號通路的異常表達(dá)在分化型甲狀腺癌發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，但該信號通路在甲狀腺未分化癌中致病機制尚不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺未分化癌中存在PI3KCA異常擴增與突變，針對該通路抑制劑的靶向治療很可能成為甲狀腺未分化癌的新興治療策略。PI3K信號通路抑制劑聯(lián)合放化療治療多種惡性腫瘤的研究已成為當(dāng)下報道焦點，但在甲狀腺未分化癌中的相關(guān)研究并不多。因此本實驗通過研究自噬對甲狀腺未分化癌發(fā)病機制及放化療增敏作用，為PI3K-AKT-mTOR信號通路抑制劑聯(lián)合放化療治療甲狀腺未分化癌加深理論認(rèn)識，并為全面完善甲狀腺未分化癌的治療策略開辟新的思路。 目的： 探討自噬對甲狀腺未分化癌發(fā)病機制及放化療增敏作用的影響，研究甲狀腺未分化癌放化療聯(lián)合自噬抑制劑對腫瘤細(xì)胞的毒性作用。 方法： （1）應(yīng)用熒光顯微鏡檢測甲狀腺未分化癌8505c細(xì)胞PI3KCA基因的沉默模型轉(zhuǎn)染效果； （2）應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測PI3K-AKT-mTOR信號通路蛋白水平變化； （3）應(yīng)用細(xì)胞增殖CCK-8實驗檢測甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505c增殖活性； （4）應(yīng)用MDC熒光法檢測甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505c自噬情況； （5）應(yīng)用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)，以P0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： （1）構(gòu)建甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505c PI3KCA沉默模型 根據(jù)GenBank中PI3KCA人全長cDNA序列信息，應(yīng)用Primer3軟件設(shè)計引物并測序，通過轉(zhuǎn)染帶有熒光素酶的慢病毒載體到8505c細(xì)胞中，建立穩(wěn)定的PI3KCA基因沉默模型，同時設(shè)立空載體作為對照實驗組，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，驗證成功后擴增培養(yǎng)。 （2）PI3KCA基因及LY294002抑制劑在癌細(xì)胞8505c中的作用機制 應(yīng)用Western Blot及方法對PI3K-AKT-mTOP信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。在癌細(xì)胞8505c中分別檢測PI3KNC組與PI3KCA沉默組，對照組與LY294002處理組中的AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-P70蛋白表達(dá)，結(jié)果表明PI3KCA沉默組的上述蛋白表達(dá)均明顯低于PI3KNC組，而LY294002處理組與對照組相比，也顯著降低上述蛋白表達(dá)。 （3）癌細(xì)胞8505c對放化療敏感性 應(yīng)用CCK-8方法對癌細(xì)胞8505c放化療作用后的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測。采用0Gy、2Gy、4Gy、6Gy不同劑量電離輻射分別處理8505c細(xì)胞后24h檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明4Gy照射組中細(xì)胞增殖活性明顯降低（P0.05），隨著劑量增加，細(xì)胞增殖活性隨之降低，細(xì)胞毒性增加，我們選擇2Gy作為實驗放療劑量。采用0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1umol/L、10umol/L不同濃度表阿霉素分別處理8505c細(xì)胞后24h檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明100nmol/L組顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P0.05），隨著濃度增加，細(xì)胞增殖活性隨之降低，細(xì)胞毒性增加，我們選擇10nmol/L作為實驗化療濃度。 （4）癌細(xì)胞8505c對抑制劑LY294002藥物敏感性 應(yīng)用CCK-8方法對癌細(xì)胞8505c經(jīng)不同濃度LY294002處理后的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測。采用DMSO溶解LY294002，配成0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/L、30umol/L、50umol/L不同濃度工作液分別處理8505C細(xì)胞后24h檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30μmol/L LY294002使細(xì)胞增殖活性明顯降低（P0.05），我們選擇10μmol/L作為實驗藥物濃度。 （5）PI3KCA基因?qū)Π┘?xì)胞8505c放療作用的影響 在癌細(xì)胞8505c中應(yīng)用CCK-8方法對PI3KNC組、PI3KCA沉默組、DMSO組及LY294002處理組給予2Gy輻射處理后分別在4h、8h、12h、24h、48h檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明，PI3KNC組在12h細(xì)胞增殖活性明顯降低，并且隨著時間延長，活性隨之降低，而PI3KCA沉默組呈現(xiàn)相同的變化趨勢，但與PI3KNC組相比，相同時間點的降低細(xì)胞增殖活性更為明顯（P0.05）。LY294002處理組與PI3KCA沉默組的作用一致，且其抑制程度較DMSO組顯著（P0.05）。 （6）PI3KCA基因?qū)Π┘?xì)胞8505c化療作用的影響 在癌細(xì)胞8505c中應(yīng)用CCK-8方法對PI3KNC組、PI3KCA沉默組、DMSO組及LY294002處理組給予10nmol/L表阿霉素處理后分別在12h、24h、36h、48h、72h檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明，PI3KNC組在36h細(xì)胞增殖活性顯著下降，并且隨著時間延長，活性隨之降低，而PI3KCA沉默組呈現(xiàn)相同的變化趨勢，但在相同時間點的細(xì)胞增殖活性明顯低于PI3KNC（P0.05）。PLY294002處理組與PI3KCA沉默組的作用一致，且作用效果較DMSO組明顯（P0.05）。 （7）自噬對癌細(xì)胞8505c放化療增敏作用的影響 在癌細(xì)胞8505c中應(yīng)用MDC熒光法對未經(jīng)處理8505c組、PI3KNC組、PI3KCA沉默組、DMSO組及LY294002處理組進(jìn)行細(xì)胞自噬檢測。分別對上述各組給予2Gy輻射，培養(yǎng)12h以及給予10nmol/L表阿霉素，培養(yǎng)36h，結(jié)果表明PI3KCA沉默組比未經(jīng)處理8505c組及PI3KNC組能明顯增加細(xì)胞自噬，而LY294002處理組細(xì)胞自噬也顯著高于未經(jīng)處理8505c組及DMSO組。 結(jié)論： 1、在甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505c中，沉默PI3KCA基因及應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002均能抑制與自噬相關(guān)PI3K-AKT-mTOR信號通路。 2、在甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505c放化療研究中，最小有效輻射劑量是2Gy，最小有效表阿霉素濃度是10nmol/L，最小有效LY294002藥物濃度是10umol/L。 3、CCK-8實驗證實沉默PI3KCA基因及應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002均能增加甲狀腺未分化癌對放化療敏感性。 4、MDC實驗證實PI3KCA基因及應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002對甲狀腺未分化癌的放化療增敏作用是通過自噬介導(dǎo)的。
【關(guān)鍵詞】：自噬 PI3K-AKT-mTOR信號通路 甲狀腺未分化癌 放化療敏感性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R736.1
【目錄】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-17
• 第一章 緒論17-23
• 1、 甲狀腺乳頭狀癌17-19
• 1.1 BRAF 癌基因18-19
• 1.2 RET/PTC 基因重排19
• 1.3 RAS 癌基因19
• 2、 濾泡型甲狀腺癌19-20
• 2.1 RAS 癌基因20
• 2.2 PAX8-PPARγ基因重排20
• 3、 未分化型甲狀腺癌20-22
• 3.1 MAPK 基因突變21
• 3.2 PI3KCA 突變與擴增21-22
• 3.3 TP53 突變22
• 4、 立題依據(jù)與展望22-23
• 第二章 材料與方法23-30
• 2.1 主要試劑及器材23-24
• 2.1.1 試劑23-24
• 2.1.2 器材24
• 2.2 主要儀器24-25
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)25
• 2.4 PI3KCA 沉默細(xì)胞模型的構(gòu)建25-26
• 2.5 蛋白制免疫印跡法（Western blot）26-28
• 2.5.1 液體配制26-27
• 2.5.2 蛋白樣品提取27
• 2.5.3 蛋白濃度測定27
• 2.5.4 SDS-PAGE 凝膠電泳27
• 2.5.5 轉(zhuǎn)膜27-28
• 2.5.6 封閉28
• 2.5.7 免疫反應(yīng)28
• 2.5.8 化學(xué)發(fā)光（ECL）與曝光28
• 2.6 放化療條件28-29
• 2.6.1 照射條件28-29
• 2.6.2 化療條件29
• 2.7 細(xì)胞增殖檢測29
• 2.8 單丹磺酰尸胺（MDC）熒光染色法檢測自噬29
• 2.9 統(tǒng)計學(xué)分析方法29-30
• 第三章 實驗結(jié)果30-35
• 3.1 構(gòu)建 8505c PI3KCA 沉默模型30
• 3.2 PI3KCA 基因及 LY294002 抑制劑在癌細(xì)胞 8505c 中的作用機制30-31
• 3.3 癌細(xì)胞 8505c 對放化療敏感性31-32
• 3.4 癌細(xì)胞 8505c 對抑制劑 LY294002 藥物敏感性32
• 3.5 PI3KCA 基因?qū)Π┘?xì)胞 8505c 放療作用的影響32-33
• 3.6 PI3KCA 基因?qū)Π┘?xì)胞 8505c 化療作用的影響33-34
• 3.7 自噬對癌細(xì)胞 8505c 放化療增敏作用的影響34-35
• 第四章 討論35-38
• 4.1 PI3KCA 在甲狀腺未分化癌中發(fā)揮的作用35-36
• 4.2 8505c 細(xì)胞對放化療的細(xì)胞毒性作用36
• 4.3 PI3KCA 對 8505c 放化療增敏作用的影響36-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-46
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及科研成果46-47
• 致謝47

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本文編號：1068407