本文關(guān)鍵詞：Caveolin-1降低EGFR突變陽性非小細(xì)胞肺癌對TKIs的敏感性

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【摘要】：目的:肺癌是癌癥相關(guān)死亡的首要原因。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%左右,大多數(shù)NSCLC診斷時已經(jīng)屬于晚期,5年生存率不足15%。以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合方案是晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案,但是化療有效率低、副作用大,近年來分子靶向治療為晚期NSCLC提供了新的選擇。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于具有酪氨酸激酶活性的HER家族中的一員。HER家族包括四大成員:HER1or EGFR,HER2,HER3及HER4。EGFR與配體特異性結(jié)合,形成同源或異源二聚體,導(dǎo)致EGFR胞內(nèi)區(qū)自動磷酸化及酪氨酸激酶激活,引起下游多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等激活,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲等。目前發(fā)現(xiàn),EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKIs)如吉非替尼、厄洛替尼等對帶有EGFR基因敏感突變包括19外顯子缺失突變、21外顯子(L858R)替代突變的晚期NSCLC病人治療有效,因此,EGFR-TKIs廣泛用于晚期NSCLC的治療,但大部分初始治療有效的病人最終會出現(xiàn)耐藥,提示可能存在其它分子影響EGFR信號通路,在NSCLC中發(fā)揮著重要作用。小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是細(xì)胞膜上Caveolae的重要組成蛋白,相對分子量21-24KDa,包括178個氨基酸殘基,C端殘基與N端殘基游離,并且伸入胞質(zhì)內(nèi),位于肽鏈中間的疏水性氨基酸殘基(102-134)形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu),將Cav-1錨定在細(xì)胞膜上。N端氨基酸殘基為Cav-1的功能區(qū),該區(qū)域與EGFR結(jié)合,從而參與腫瘤細(xì)胞增殖、粘附、遷移和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此,推測Cav-1的表達(dá)可影響NSCLC對EGFR-TKIs的敏感性。本研究利用帶有EGFR敏感突變的NSCLC細(xì)胞株P(guān)C-9,通過:(1)采用Western blot驗證Cav-1過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。(2)采用MTS比色分析法、劃痕修復(fù)試驗、Transwell法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株增殖、遷移及侵襲能力的影響;(3)采用Western blot法,檢測厄洛替尼對EGFR及下游信號通路中各激酶活化水平的影響。旨在探討Cav-1的表達(dá)是否可影響NSCLC對EGFR-TKIs的敏感性。方法1 Western bolt驗證Cav-1過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株利用Western bolt方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中Cav-1蛋白水平。2 MTS比色分析法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力的影響將PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞分別接種于96孔板,次日換用含不同濃度厄洛替尼(0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32μmol/L)的完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,加入MTS溶液,通過測定各孔的吸光度(OD)值,計算細(xì)胞生長抑制率和厄洛替尼的半數(shù)抑制濃度(IC50)。3劃痕修復(fù)實驗檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力的影響將PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞分別接種于24孔板,24h后用10μl移液器吸頭劃痕,PBS洗去漂浮的細(xì)胞,兩種細(xì)胞都分別于完全1640培養(yǎng)液及含濃度為0.04μmol/L厄洛替尼的完全1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察并拍照,每6h拍照一次,直至劃痕愈合,測量劃痕寬度變化,計算細(xì)胞遷移率。遷移率=(劃痕初始寬度-目前寬度)/2/劃痕初始寬度×100%。4 Transwell法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力的影響鋪基質(zhì)膠于Transwell小室的上室,將PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞分別接種于上室,兩種細(xì)胞都分別于無胎牛血清的1640培養(yǎng)液及含濃度為0.04μmol/L厄洛替尼的無胎牛血清1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),下室放入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,95%冰乙醇固定,HE染色,顯微鏡下拍照,每個小室隨機(jī)選取上、下、左、右及中心共5個視野,計算穿膜細(xì)胞數(shù)。5 Western blot檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR活化水平及其下游信號通路分子的影響將PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿,予以濃度為0.04μmol/L厄洛替尼進(jìn)行藥物干預(yù),分別于0h、4h后,收集細(xì)胞,提取總蛋白,Western blot檢測p Y-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、Cav-1的蛋白水平,β-actin作為內(nèi)參蛋白。結(jié)果:1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Cav-1蛋白水平采用Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Cav-1蛋白水平,結(jié)果顯示:PC-9/Cav-1細(xì)胞Cav-1蛋白的相對表達(dá)量(1.74±0.06)明顯高于PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞(0.61±0.99),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(P0.05)2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對厄洛替尼敏感性的變化2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞厄洛替尼的IC50MTS法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示:給予不同濃度厄洛替尼作用的PC-9/Cav-1細(xì)胞的生長抑制率均低于相應(yīng)濃度的PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PC-9/Cav-1組厄洛替尼的IC50值(0.06±0.01)明顯高于PC-9/pc DNA3.1組(0.03±0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。表明PC-9/Cav-1細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性低于PC-9/pc DNA3.1細(xì)胞。2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力的變化及對厄洛替尼作用的影響劃痕修復(fù)實驗檢測細(xì)胞遷移能力的結(jié)果顯示:在無厄洛替尼作用下,PC-9/Cav-1組細(xì)胞6h、12h、18h的遷移率(14.81±0.84%,27.98±0.73%,39.34±0.54%)均明顯高于PC-9/pc DNA3.1組(12.89±0.81%,19.93±1.99%,26.07±0.68%),均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在0.04μmol/L厄洛替尼作用下,PC-9/Cav-1組細(xì)胞6h、12h、18h的遷移率(10.66±1.19%,14.61±2.23%,19.77±0.83%)明顯高于PC-9/pc DNA3.1組細(xì)胞(4.80±1.04%,9.34±1.77%,14.14±2.61%),均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力的變化及對厄洛替尼作用的影響Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果顯示:在0μmol/L厄洛替尼作用下的PC-9/Cav-1組穿膜細(xì)胞數(shù)(79.00±4.60)明顯多于PC-9/pc DNA3.1組(56.33±6.50),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在0.04μmol/L厄洛替尼作用下的PC-9/Cav-1組穿膜細(xì)胞數(shù)(49.00±3.60)明顯多于PC-9/pc DNA3.1組(34.33±4.90),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR活化水平及其下游信號通路分子的影響Western blot檢測0μmol/L、0.04μmol/L厄洛替尼作用后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)水平,經(jīng)灰度掃描,結(jié)果顯示:0μmol/L、0.04μmol/L厄洛替尼作用后,PC-9/Cav-1組p Y-EGFR的水平(2.25±0.29,2.01±0.13)均明顯高于PC-9/pc DNA3.1組(1.54±0.09,1.02±0.05),均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PC-9/Cav-1組p-ERK的水平(2.24±0.05,0.80±0.15)均明顯高于PC-9/pc DNA3.1組(1.36±0.02,0.28±0.02),均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);PC-9/Cav-1組p-Akt的水平(0.83±0.02,0.64±0.01)明顯高于PC-9/pc DNA3.1組(0.52±0.03,0.30±0.03),均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1 Cav-1減弱厄洛替尼對PC-9細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。2 Cav-1通過減弱厄洛替尼對PC-9細(xì)胞EGFR及下游Ras/Raf/MEK/ERK及PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激酶活化的抑制作用,降低厄洛替尼對PC-9細(xì)胞的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 厄洛替尼 小凹蛋白-1 表皮生長因子受體 酪氨酸激酶抑制劑
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-24
• 結(jié)果24-27
• 附圖27-33
• 附表33-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述 非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療進(jìn)展44-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Kim-Son H Nguyen;Joel W Neal;Heather Wakelee;;Review of the current targeted therapies for non-small-cell lung cancer[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年04期

2 宋正波;陸舜;虞永峰;李子明;廖美琳;陳智偉;;化療間期序貫應(yīng)用厄洛替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2010年01期

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本文編號：1066654