本文關(guān)鍵詞：sTRAIL蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及抗腫瘤活性研究

  更多相關(guān)文章： 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體 基因克隆 原核表達(dá) 蛋白純化 抗腫瘤活性

【摘要】：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族中新發(fā)現(xiàn)的一員,是人體內(nèi)正常表達(dá)的一種蛋白分子。TRAIL蛋白能特異的與某些腫瘤細(xì)胞表面的凋亡受體結(jié)合,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且不誘導(dǎo)正常細(xì)胞和組織凋亡,也不像已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡因子TNF-α?xí)a(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。TRAIL蛋白這一關(guān)鍵特性的發(fā)現(xiàn),使其成為目前腫瘤治療研究中的熱點。完整的TRAIL蛋白含有281個氨基酸殘基,但其完整的蛋白分子在原核細(xì)胞中可溶性低,限制了其的應(yīng)用。但TRAIL蛋白分子的114-281位氨基酸片段(soluble TRAIL,sTRAIL)在原核表達(dá)中的可溶性大大提高,且保持了活性。利用微生物作為宿主表達(dá)抗腫瘤外源蛋白,原因在于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、表達(dá)量較高,利于發(fā)酵制備物的提取、純化、控制等優(yōu)點,研究工作日益受到重視。本研究通過培養(yǎng)人早幼粒白細(xì)胞HL-60細(xì)胞,提取總RNA,通過RT-PCR擴(kuò)增sTRAIL蛋白基因片段,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-sTrail。鑒定成功以及測序正確后電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),利用IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)sTRAIL蛋白。經(jīng)過對誘導(dǎo)溫度,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速以及IPTG濃度的優(yōu)化,確定了在16℃、IPTG濃度為0.1mM、誘導(dǎo)時間12 h的誘導(dǎo)條件下可溶蛋白含量最高。通過優(yōu)化Ni-IDA層析柱純化重組蛋白條件,SDS-PAGE蛋白電泳以及膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定,確定純化收集的蛋白為sTRAIL蛋白。純化后的sTRAIL蛋白對人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人肝癌細(xì)胞(Hep-3B)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H460)等腫瘤細(xì)胞有良好的抑制效果,通過MTT法檢測,在sTRAIL蛋白濃度為1200 ng/mL,作用48 h后,對上述細(xì)胞的抑制率分別為32.9%、27.2%、29.7%、22.5%和10.8%,存在濃度依賴性。從倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),越來越多的腫瘤細(xì)胞從梭形或不規(guī)則形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形,且細(xì)胞變厚,透光率發(fā)生變化。同時sTRAIL蛋白對正常的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。本研究對sTrail重組基因的克隆,sTRAIL蛋白表達(dá)、純化以及抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。sTRAIL蛋白所具有良好的抗腫瘤生物活性,且對正常細(xì)胞無害,有望成為新型的能在臨床抗腫瘤的藥物分子。本研究為sTRAIL蛋白的潛在開發(fā)應(yīng)用提供了新的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體 基因克隆 原核表達(dá) 蛋白純化 抗腫瘤活性
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-24
• 1 TRAIL與腫瘤治療11-21
• 1.1 TRAIL的結(jié)構(gòu)11-13
• 1.2 TRAIL的受體種類13-16
• 1.3 TRAIL誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制16-17
• 1.4 TRAIL誘導(dǎo)凋亡的調(diào)控17-21
• 1.5 TRAIL的其他生物活性21
• 2 抗腫瘤蛋白的研究進(jìn)展21-24
• 2.1 微生物、真菌抗腫瘤蛋白21-22
• 2.2 動物、植物抗腫瘤蛋白22-24
• 第二章 材料與方法24-36
• 1 材料24-29
• 1.1 菌株與質(zhì)粒24
• 1.2 引物24
• 1.3 培養(yǎng)基和抗生素24-25
• 1.4 主要試劑25-28
• 1.5 儀器與設(shè)備28
• 1.6 細(xì)胞株28-29
• 2 方法29-36
• 2.1 sTrail基因的獲取29-31
• 2.2 表達(dá)載體pET28a-sTrail的構(gòu)建及檢測31-32
• 2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）32-33
• 2.4 E. coli BL21（DE3）（p ET28a-sTrail）中sTRAIL的誘導(dǎo)表達(dá)33
• 2.5 重組菌株中s TRAIL的SDS-PAGE檢測33
• 2.6 sTRAIL的質(zhì)譜鑒定33-34
• 2.7 sTRAIL蛋白的收集純化34
• 2.8 細(xì)胞培養(yǎng)、增殖與傳代34-35
• 2.9 sTRAIL蛋白的抗腫瘤活性檢測35-36
• 第三章 結(jié)果與分析36-43
• 1 sTrail基因的獲取36-37
• 1.1 HL-60細(xì)胞中總RNA的提取36
• 1.2 sTrail基因的擴(kuò)增36-37
• 2 構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)載體p ET28a-sTrail的鑒定37-38
• 3 sTRAIL蛋白的表達(dá)與檢測38-40
• 4 sTRAIL蛋白的純化與定量40-41
• 5 sTRAIL蛋白的抗腫瘤活性檢測41-43
• 第四章 討論43-46
• 1 sTRAIL蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)的選擇43
• 2 sTRAIL蛋白誘導(dǎo)和純化條件的優(yōu)化43-45
• 3 sTRAIL蛋白抗腫瘤活性的分析45-46
• 結(jié)論與展望46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 縮略語表53-54
• 論文發(fā)表情況54-55
• 項目資助情況55-56
• 致謝56

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1065712