本文關(guān)鍵詞：TALEN介導(dǎo)MGC803細(xì)胞MYH9基因沉默及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

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【摘要】：胃癌(gastric cancer, GC)是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2015年最新統(tǒng)計(jì)的全球癌癥數(shù)據(jù)表明,截止2012年,全世界每年約有95.16萬(wàn)胃癌新增病例,并且每年大約有72.31萬(wàn)人死于胃癌。中國(guó)、日本和韓國(guó)等東亞地區(qū)國(guó)家依舊是全世界胃癌高發(fā)地區(qū),日本和韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家因經(jīng)濟(jì)水平高、醫(yī)療服務(wù)體系健全,早期發(fā)現(xiàn)診斷胃癌患者居多,所以預(yù)后相對(duì)較好；約40%的胃癌發(fā)生于中國(guó),而中國(guó)因經(jīng)濟(jì)條件差、醫(yī)療水平相對(duì)落后,許多胃癌患者明確診斷時(shí)已經(jīng)處于中晚期,因此胃癌死亡率明顯高于前者。在我國(guó),最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,2015年中國(guó)估計(jì)有429.2萬(wàn)個(gè)癌癥新發(fā)病例和281.4萬(wàn)例癌癥死亡病例。胃癌發(fā)病率位居男性和女性腫瘤發(fā)病原因的第二位和第三位,同時(shí)也位居因惡性腫瘤死亡原因的前列。盡管隨著大量臨床、基礎(chǔ)研究的進(jìn)行以及科技的進(jìn)步與發(fā)展,胃癌的診療技術(shù)取得了長(zhǎng)足發(fā)展,但其預(yù)后仍不容樂(lè)觀。影響胃癌預(yù)后的因素很多,其中浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移仍然是影響胃癌預(yù)后的主要因素之一,腹膜轉(zhuǎn)移是最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式,占所有轉(zhuǎn)移病例的31%,平均生存時(shí)間不足6個(gè)月。腹膜轉(zhuǎn)移后導(dǎo)致腫瘤無(wú)法根治性切除,同時(shí)腹膜轉(zhuǎn)移常合并粘連性腸梗阻、大量腹水等癥狀,這些因素常導(dǎo)致患者生存質(zhì)量差、短期死亡。因此,我們應(yīng)該積極尋找胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子,研究胃癌發(fā)生發(fā)展及腹膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中的具體分子機(jī)制,為胃癌患者的個(gè)體化治療提供依據(jù)。只有通過(guò)這種方式,才有可能做到胃癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療,改善胃癌患者的預(yù)后,為胃癌診療技術(shù)的發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為了更好的研究與胃癌發(fā)生發(fā)展及腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制,我們首先必須得了解腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)理論知識(shí)。腫瘤是由遺傳因素、環(huán)境因素及生活習(xí)慣等造成的,是一個(gè)分階段、分步驟,并由多種信號(hào)通路共同參與的極為復(fù)雜的過(guò)程。目前公認(rèn)的關(guān)于胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移的理論主要有四種,直接侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在胃癌中最為常見(jiàn),它主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移到胃周各站淋巴結(jié),此外,腫瘤還可以跳躍轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處淋巴結(jié),胃周淋巴結(jié)的清掃對(duì)于胃癌術(shù)后病理分期、后續(xù)治療及預(yù)后的評(píng)估具有重要作用。種植轉(zhuǎn)移是引起胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的主要原因,胃癌起源于粘膜層,突破漿膜層后因腫瘤細(xì)胞脫落至腹腔引起胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。既往大量研究證明,正常組織、腫瘤原發(fā)灶和腫瘤轉(zhuǎn)移灶之間存在許多的差異性表達(dá)基因,正是因?yàn)檫@些差異性表達(dá)的基因,導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、粘附能力、運(yùn)動(dòng)能力等出現(xiàn)明顯改變,進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。近年來(lái),隨著蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一。在對(duì)癌癥等人類(lèi)重大疾病的臨床診斷和治療方面,蛋白質(zhì)組技術(shù)也有十分誘人的前景。蛋白質(zhì)是生理功能和生命現(xiàn)象的執(zhí)行者與直接體現(xiàn)者,因此,對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究將有助于闡明生命在不同條件下的變化機(jī)制。蛋白質(zhì)自身的存在形式與活動(dòng)規(guī)律,例如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)之間相互作用及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問(wèn)題,仍依靠直接對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究來(lái)解決,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用等幾乎無(wú)法從mRNA水平來(lái)判斷。蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳—質(zhì)譜(Two-dimensional polyacry-lamide gel electrophoresis- mass spec-trometry,2-DE-MS)技術(shù),即利用雙向凝膠電泳將所有蛋白質(zhì)分離,然后通過(guò)質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)逐一鑒定,因雙向凝膠電泳技術(shù)具有繁瑣、不穩(wěn)定和低靈敏度等缺點(diǎn),熒光差異凝膠電泳(difference gel electrophoresis, DIGE)技術(shù)因具有高通量、高靈敏度及高精度等優(yōu)勢(shì),逐漸成為最受歡迎的蛋白組學(xué)研究技術(shù)之一。立足于臨床,針對(duì)胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移給臨床工作帶來(lái)的挑戰(zhàn),旨在尋找與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物和生物治療靶點(diǎn)。前期運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)6例胃癌晚期患者(行腹腔鏡下胃癌姑息性切除術(shù))的腫瘤原發(fā)灶、腹膜轉(zhuǎn)移灶及相應(yīng)胃正常上皮間組織標(biāo)本進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析,共鑒定出35個(gè)胃癌組織中表達(dá)異常的蛋白質(zhì),經(jīng)進(jìn)一步分析及驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈(Myosin, heavy chain 9,non-muscle,MYH9)及人類(lèi)紅細(xì)胞膜整合蛋白樣蛋白2(Stomatin-like protein 2, SLP-2)與胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者預(yù)后相關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,MYH9參與細(xì)胞的極性形成、收縮、遷移、細(xì)胞分裂等過(guò)程,它與許多疾病的發(fā)生有關(guān),如遺傳性血小板減少癥、皰疹病毒感染及胚胎發(fā)育等。其在諸多實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常,在胃癌、結(jié)腸癌、食管癌及乳腺癌中促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,而在頭頸部鱗癌中扮演抑癌角色,并與預(yù)后呈正相關(guān)。作為細(xì)胞中的“分子馬達(dá)”,MYH9異常如何影響胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移引起我們的興趣,我們前期通過(guò)慢病毒干擾構(gòu)建MYH9基因敲低穩(wěn)定細(xì)胞株,采用最有效和最穩(wěn)定單克隆株進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：干擾組感染病毒的胃癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞間連接疏松、細(xì)胞胰酶消化時(shí)收縮能力減弱；熒光顯微鏡下同一視野感染病毒的細(xì)胞與未感染細(xì)胞形態(tài)相差顯著。同時(shí),MYH9基因敲低后細(xì)胞水平遷移能力增強(qiáng)、侵襲能力減弱。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn),遷移與侵襲能力不一致考慮MYH9作為一個(gè)骨架蛋白,主要參與細(xì)胞錨定、粘附等過(guò)程。因此MYH9減少使細(xì)胞粘附減少,水平隨機(jī)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)。因慢病毒干擾構(gòu)建MYH9基因敲低穩(wěn)定細(xì)胞株存在一些局限性：1、MYH9基因敲低細(xì)胞株構(gòu)建成功后,隨著細(xì)胞培養(yǎng)及傳代次數(shù)增加,未轉(zhuǎn)染進(jìn)病毒的細(xì)胞增殖逐漸增多,不能獲得穩(wěn)定敲低的細(xì)胞株；2、慢病毒轉(zhuǎn)進(jìn)去后,能在顯微鏡下觀察到熒光,但其不發(fā)揮相應(yīng)的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證慢病毒干擾構(gòu)建MYH9基因敲低穩(wěn)定細(xì)胞株后的相關(guān)生物學(xué)功能,同時(shí)作為潛在的治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo),MYH9如何影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為也是我們后續(xù)的分子機(jī)制研究重點(diǎn)。因此,獲得可靠的基因敲除細(xì)胞模型是深入研究特定基因功能的有力保證。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展,基因編輯技術(shù)不斷涌現(xiàn)并改進(jìn),本研究選用效果穩(wěn)定可靠的類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN)技術(shù)構(gòu)建胃癌細(xì)胞系MGC803 MYH9基因沉默單克隆株模型,并初步檢測(cè)MYH9沉默后對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,為進(jìn)一步探索MYH9分子機(jī)制提供可靠模型及潛在研究方向,為研究胃癌與腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本課題由兩個(gè)部分組成,具體內(nèi)容如下：第一章利用TALEN技術(shù)構(gòu)建胃癌細(xì)胞MYH9基因沉默細(xì)胞株目的：利用新興的基因編輯技術(shù)TALEN技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的胃癌細(xì)胞MGC803MYH9基因沉默細(xì)胞株。方法：根據(jù)斯丹賽FastTALETM TALEN試劑盒說(shuō)明書(shū),設(shè)計(jì)并構(gòu)建靶向MYH9基因的TALEN質(zhì)粒對(duì)。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、DNA測(cè)序、RT-PCR和western blot等檢測(cè)質(zhì)�；钚�,成功挑取MYH9基因敲低單克隆株。結(jié)果：成功構(gòu)建MYH9基因敲低單克隆細(xì)胞株,因MYH9敲除后細(xì)胞致死性,無(wú)法得到MYH9基因完全敲除細(xì)胞株。第二章MGC803 MYH9基因敲低細(xì)胞株驗(yàn)證及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。目的：驗(yàn)證TALEN技術(shù)構(gòu)建的MYH9基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞株,并對(duì)其相關(guān)的細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行研究,為探索MYH9分子機(jī)制提供可靠模型及潛在研究方向。方法：利用qRT-PCR和Western blot方法在mRNA和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)構(gòu)建成功的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：1.成功挑選的單克隆細(xì)胞株中MYH9基因在mRNA和蛋白水平均明顯低于野生型對(duì)照組。2.MYH9敲低后細(xì)胞增殖能力下降。3.與野生型對(duì)照組相比,MYH9基因敲低后細(xì)胞增殖能力下降,細(xì)胞周期受阻于G2/M期(P=0.024),不能進(jìn)入M期進(jìn)行正常的有絲分裂,同時(shí)早期凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P=0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)上述研究,我們可以得到以下結(jié)論：1.通過(guò)TALEN技術(shù),我們成功構(gòu)建了胃癌細(xì)胞MGC803 MYH9基因穩(wěn)定敲低細(xì)胞株,通過(guò)對(duì)其驗(yàn)證及相關(guān)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),我們得到了穩(wěn)定的胃癌MYH9基因敲低單克隆細(xì)胞株,為進(jìn)一步研究胃癌MYH9功能提供了可靠模型,同時(shí)也說(shuō)明TALEN技術(shù)是一種有效、穩(wěn)定的基因編輯技術(shù)。2.因只能獲得MYH9基因敲低細(xì)胞株,而無(wú)法得到MYH9基因完全敲除細(xì)胞株,這也從側(cè)面反應(yīng)出了MYH9基因的重要性。3.MYH9基因敲低后細(xì)胞增殖能力下降,細(xì)胞周期受阻于G2/M期、早期凋亡增加,對(duì)于細(xì)胞凋亡增多,無(wú)法用MYH9基因作為一個(gè)骨架蛋白來(lái)解釋,MYH9是否通過(guò)其它機(jī)制影響胃癌的發(fā)生發(fā)展?這為進(jìn)一步研究MYH9基因分子機(jī)制提供了潛在研究方向。本研究的創(chuàng)新之處：首次利用基因編輯技術(shù)TALEN技術(shù)成功構(gòu)建胃癌細(xì)胞MGC803 MYH9基因敲低細(xì)胞株。
【關(guān)鍵詞】：TALEN MYH9 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-21
• 第一章 利用TALEN技術(shù)構(gòu)建胃癌細(xì)胞MYH9基因沉默細(xì)胞株21-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件21
• 1.2 主要試劑及耗材21-22
• 1.3 主要儀器22-23
• 1.4 主要溶液配制23
• 2 試驗(yàn)方法23-31
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇23-25
• 2.2 TALEN質(zhì)粒左右臂構(gòu)建25-29
• 2.3 TALEN質(zhì)�；钚詸z測(cè)29-30
• 2.4 利用TALEN質(zhì)粒建立MGC-803MYH9基因敲低細(xì)胞系30-31
• 3 結(jié)果31-33
• 3.1 構(gòu)建TALEN質(zhì)粒左右臂31
• 3.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并測(cè)活性31-32
• 3.3 篩選陽(yáng)性克隆并成功構(gòu)建MYH9基因敲低單克隆細(xì)胞株32-33
• 4 討論33-36
• 第二章 MGC803 MYH9基因沉默細(xì)胞株驗(yàn)證及細(xì)胞增殖與凋亡功能檢測(cè)36-55
• 1 實(shí)驗(yàn)材料36-38
• 1.1 主要試劑及耗材36
• 1.2 主要儀器36-37
• 1.3 主要溶液配制37-38
• 2 實(shí)驗(yàn)方法38-48
• 2.1 qRT-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞中MYH9 mRNA表達(dá)38-41
• 2.2 Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞中MYH9蛋白表達(dá)41-47
• 2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖47
• 2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期47-48
• 2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況48
• 2.6 統(tǒng)計(jì)方法48
• 3 結(jié)果48-53
• 3.1 胃癌細(xì)胞株中MYH9基因在mRNA水平的表達(dá)情況48-49
• 3.2 胃癌細(xì)胞株中MYH9基因在蛋白水平的表達(dá)情況49-50
• 3.3 MYH9基因敲低后細(xì)胞生長(zhǎng)速度受到抑制50-51
• 3.4 MYH9基因敲低后細(xì)胞周期受阻于G2/M期51-52
• 3.5 MYH9基因敲低后細(xì)胞早期凋亡增加52-53
• 4 討論53-55
• 全文小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 中英文縮略詞表63-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果66-67
• 致謝67-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Incidence and mortality of gastric cancer in China[J];World Journal of Gastroenterology;2006年01期

，

本文編號(hào)：1055294