發(fā)布時(shí)間：2017-10-18 00:29

  本文關(guān)鍵詞：二烯丙基二硫化物對(duì)人白血病KG1-α細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其機(jī)制的研究

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【摘要】：背景目的白血病是高發(fā)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤,其治療以化療、骨髓移植為主。而由于部分化療藥物的耐藥及化療嚴(yán)重副作用,白血病的預(yù)后較差,因此迫切需要尋找新的有效的治療方法或者藥物靶點(diǎn)。二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide, DADS)是大蒜中一種脂溶性有效成分,對(duì)前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞均有抑制作用,。其主要作用機(jī)制是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)腫瘤凋亡和分化,增加組蛋白乙�；胶鸵种颇[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝方式,即在氧氣充足的條件下,腫瘤細(xì)胞并不依賴線粒體進(jìn)行氧化磷酸化功能,而是攝取大量葡萄糖,產(chǎn)生乳酸及能量,該過(guò)程叫有氧糖酵解。丙酮酸激酶MII(pyruvate kinase isoenzyme typeM2, PKM2)是該過(guò)程的關(guān)鍵酶,它催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)產(chǎn)生丙酮酸。Christofk等的研究發(fā)現(xiàn)PKM2表達(dá)增加可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解異常代謝,采用shRNA敲除人肺癌細(xì)胞株H1299中PKM2基因并以PKM1替代,可使、Varburg效應(yīng)逆轉(zhuǎn),同時(shí)將這種處理過(guò)的H1299細(xì)胞株接種裸鼠,發(fā)現(xiàn)其致瘤性明顯降低,從而證實(shí)PKM2在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要作用。通常情況下PKM2以二聚體和四聚體的形式存在,其不同的形式表現(xiàn)出不同的酶活性,其中只有二聚體形式的PKM2能入核參與基因轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Yang[25,26]等報(bào)道了PKM2入核與激活表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)有關(guān)。那么,DADS對(duì)白血病細(xì)胞的增殖是否有影響?其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制是否與PKM2有關(guān)?DADS能否影響PKM2的表達(dá)或入核?目前尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。方法第一部分通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)人白血病HL-60、K562、KG1-α細(xì)胞株以及正常人單個(gè)核細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)量。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)DADS對(duì)人白血病KG1-α細(xì)胞增殖的影響。采用FCM檢測(cè)DADS對(duì)人白血病KG1-a細(xì)胞周期和凋亡的影響。lochest染色觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)檢測(cè)DADS對(duì)人白血病KG1-a細(xì)胞的CCND1、c-Myc的mlNA表達(dá)量的影響。應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)DADS對(duì)KG1-α細(xì)胞中Bax、Bcl-2、 Cleaved-caspase 3、CyclinD1、P21蛋白表達(dá)的影響；分別提取核蛋白、漿蛋白。采用蛋白免疫印跡法和免疫熒光檢測(cè)DADS對(duì)細(xì)胞核核細(xì)胞漿中PKM2表達(dá)的影響。運(yùn)用免疫熒光檢測(cè)DADS處理后PKM2在KG1-α細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布的變化。第二部分為更進(jìn)一步闡明DADS對(duì)PKM2影響的機(jī)制,采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)DADS對(duì)P-EGFR、P-ERK、P-MEK1/2、EGFR、ERK、MEK、PIN1、p-catenin表達(dá)的影響。以及單獨(dú)使用EGFR抑制劑AG-1478或聯(lián)合DADS誘導(dǎo)對(duì)PKM2入核通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、Western Blot篩選結(jié)果,人白血病細(xì)胞株KG1-α中PKM2蛋白表達(dá)最高。2、CCK-8結(jié)果顯示DADS對(duì)人白血病細(xì)胞株KG1-α的增殖抑制作用明顯。3、FCM檢測(cè)細(xì)胞周期：DADS誘導(dǎo)KG1-α后使得細(xì)胞周期阻滯G0/G1期,G2/M期、S期所占比例減少。G0/G1期比例：空白對(duì)照組(41.19±0.05)%,50μmol/L處理組為(54.32±0.02)%,10μmol/L處理組為(68.70±0.02)%。(P0.05)4、FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡：空白對(duì)照組凋亡率(1.98±0.23)%,50 μmol/ L處理組(17.75±0.80)%,100μmol/L處理組為(23.01±1.27)%。(P0.05)5、Hochest染色結(jié)果顯示,經(jīng)DADS誘導(dǎo)后,KG1-α細(xì)胞產(chǎn)生了典型凋亡形態(tài)學(xué)改變。6、RT-PCR結(jié)果顯示,DADS下調(diào)CCND1、c-Myc的nRNA的表達(dá)水平。7、Western Blot結(jié)果,DADS可減少細(xì)胞核中PKM2的積聚,對(duì)細(xì)胞質(zhì)中PKM2的表達(dá)則無(wú)明顯影響。DADS上調(diào)Bax. P21、 Cleaved Caspase-3的表達(dá),下調(diào)Bc1-2、CyclinD1的表達(dá)。8、免疫熒光結(jié)果顯示：經(jīng)DADS誘導(dǎo)8h后,藥物組細(xì)胞在細(xì)胞核內(nèi)的PKM2表達(dá)明顯下降。9、Western Blot結(jié)果,DADS可下調(diào)P-EGFR、P-ERK、P-MEK1/2。應(yīng)用EGFR抑制劑AG-1478抑制EGFR磷酸化,阻斷EGFR/ERK/PKM2信號(hào)通路后,細(xì)胞核中PKM2的含量減低；聯(lián)合應(yīng)用DADS, PKM2水平比單用AG-1478或DADS降低更明顯。P-EGFR、P-ERK、P-MEK1/2蛋白表達(dá)水平亦如此。結(jié)論1、在人白血病細(xì)胞中KG1-α細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)最高,DADS對(duì)KG1-α細(xì)胞有明顯增殖抑制的作用,通過(guò)將阻滯在G0/G1期,抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。2、DADS通過(guò)上調(diào)Bax、P21、Cleaved Caspase-3的表達(dá),下調(diào)Bcl-2、CyclinD1的表達(dá),使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,抑制KG1-α細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡。3、DADS可減少核內(nèi)PKM2的積聚,通過(guò)EGFR/ERK/PKM2信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡。
【關(guān)鍵詞】：二烯丙基二硫 白血病細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞增殖 PKM2
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-17
• 前言17-19
• 第一部分 二烯丙基二硫?qū)θ税籽〖?xì)胞增殖、凋亡的影響19-44
• 前言19
• 1 材料和方法19-30
• 2 結(jié)果30-36
• 3 討論36-40
• 第一部分圖片40-44
• 第二部分 二烯丙基二硫?qū)Π籽〖?xì)胞KG1-α EGFR/ERK/PKM2信號(hào)通路的影響44-56
• 前言44
• 1 材料和方法44-47
• 2 結(jié)果47-51
• 3 討論51-54
• 第二部分圖片54-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 文獻(xiàn)綜述：二烯丙基二硫抗腫瘤機(jī)制61-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69-70
• 碩士期間發(fā)表的論文70

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本文編號(hào)：1051918