發(fā)布時(shí)間：2017-10-17 21:41

  本文關(guān)鍵詞：胃組織紅桂木凝集素受體表達(dá)的研究

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【摘要】：研究背景和目的：目前惡性腫瘤是疾病死亡的首位原因。細(xì)胞癌變、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移往往表現(xiàn)為細(xì)胞膜上糖蛋白或糖脂的改變,根據(jù)凝集素對(duì)糖及其綴合物高度專一識(shí)別的特性,可利用外源植物凝集素作為探針在分子水平上研究細(xì)胞惡變過(guò)程中膜結(jié)構(gòu)的改變。本課題首先將紅桂木凝集素進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素標(biāo)記,然后進(jìn)行凝集素組化染色,觀察胃癌組織和胃正常組織中紅桂木凝集素受體的表達(dá)差異,為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及紅桂木凝集素在腫瘤診斷中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：一、分離純化紅桂木凝集素：參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離、純化紅桂木凝集素的方法,將紅桂木種子研磨,硫酸鹽分級(jí)沉淀法鹽析蛋白,采用Gal-Sepharose 6B親和層析純化蛋白,透析、超濾、凍干、儲(chǔ)存。紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紅桂木凝集素活性。二、ALL-FITC和ALL-HRP的制備1.ALL-FITC的制備：(1)透析法制備ALL-FITC：將紅桂木凝集素凍干粉配制成溶液,測(cè)定濃度,加入FITC,將溶液充分混勻,透析,測(cè)定偶聯(lián)物F/P值。(2)固化法制備ALL-FITC：先將紅桂木凝集素與Sepharose 4B固相吸附,再將FITC溶液滴入凝膠柱內(nèi),用Gal-PBS洗脫ALL-FIT C,測(cè)定該偶聯(lián)物F/P值。(3)比較兩種方法的F/P值。2.ALL-HRP的制備：ALL-HRP的制備：采用高碘酸鹽氧化法制備,將HRP在高碘酸鈉溶液中對(duì)乙酸緩沖液透析,再加入已測(cè)定好濃度的紅桂木凝集素溶液,透析后避光保存。三、胃組織中紅桂木凝集素受體的表達(dá)分析1.病例收集：收集32例胃腺癌癌變組織切片和25例胃正常組織切片。2.ALL-FITC染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,將ALL-FITC覆蓋于組織上,避光孵育,復(fù)染DAPI,利用熒光倒置顯微鏡觀察紅桂木凝集素受體表達(dá)情況。3. ALL-HRP染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,將ALL-HRP覆蓋于組織上,避光孵育,再用蘇木精復(fù)染,DAB試劑盒顯色,在顯微鏡下觀察紅桂木凝集素受體表達(dá)情況。四、ALL-Sepharose 6B的制備：將活化好的Sepharose 6B與ALL親和吸附,封閉Sepharose 6B其余的活性基團(tuán),測(cè)定ALL-Sepharose 6B的凝血活性。結(jié)果：一、從紅桂木種子中分離純化得到紅桂木凝集素,經(jīng)紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè),凝集活力為29-211。二、透析法制備ALL-FITC的F/P值為0.758,固化法的F/P值為1.02,兩種方法所制備的ALL-FITC用于石蠟切片染色均得到較好的效果。三、胃癌組織紅桂木凝集素受體的表達(dá)觀察1. ALL-FITC染色：正常胃組織經(jīng)染色后在熒光顯微鏡下可看到較微弱的綠色熒光,胃腺癌切片在鏡下可看見(jiàn)明亮的綠色熒光,藍(lán)色細(xì)胞核分布在綠色熒光中,說(shuō)明紅桂木凝集素受體主要分布在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)。胃正常組織和胃腺癌組織均有紅桂木凝集素受體表達(dá),胃腺癌組織陽(yáng)性率為68.8%,胃正常組織陽(yáng)性率為24%,兩組受體表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001),表明胃腺癌組織紅桂木凝集素受體表達(dá)明顯多于正常胃組織的。2. ALL-HRP染色：鏡下觀察胃正常組織輕微著染,胃腺癌組織則著染為棕褐色,受體主要分布在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi),有些受體主要分布在癌細(xì)胞的一側(cè)胞漿中,有的則散布在整個(gè)胞漿內(nèi),細(xì)胞核未見(jiàn)著染。胃正常組織和胃腺癌組織均有紅桂木凝集素受體表達(dá),胃腺癌組織陽(yáng)性率為75%,胃正常組織陽(yáng)性率為16%,兩組受體表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000.),表明胃腺癌組織紅桂木凝集素受體表達(dá)明顯多于正常胃組織的。四、偶聯(lián)Sepharose 6B的ALL可使紅細(xì)胞凝集,說(shuō)明Sepharose 6B已成功偶聯(lián)ALL。結(jié)論：一、固化法制備ALL-FITC優(yōu)于透析法。二、本實(shí)驗(yàn)制備的ALL-FITC和ALL-HRP均可用于組織細(xì)胞紅桂木凝集素受體的表達(dá)分析。三、紅桂木凝集素受體在胃腺癌組織比胃正常組織表達(dá)明顯增多,主要分布在癌細(xì)胞胞漿。四、本課題組制備的ALL-Sepharose 6B可用于下一步的糖蛋白分離純化。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 紅桂木凝集素受體 FITC標(biāo)記凝集素 HRP標(biāo)記凝集素 ALL偶聯(lián)Sepharose 6B
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-6
• 英文縮略語(yǔ)表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 第一部分 紅桂木凝集素的分離純化18-25
• 一、 材料與方法18-23
• 二、 結(jié)果23-24
• 三、 討論24-25
• 第二部分 紅桂木凝集素受體在胃組織中的表達(dá)25-40
• 一、 材料與方法25-31
• 二、 結(jié)果31-37
• 三、 討論37-40
• 第三部分 紅桂木凝集素偶聯(lián)瓊脂糖凝膠的制備40-44
• 一、 材料與方法40-42
• 二、 結(jié)果42-43
• 三、 討論43-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 綜述48-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60-61
• 附件61-63

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本文編號(hào)：1051212